论文部分内容阅读
水牛耐粗饲,可能与瘤胃菌群降解木质纤维的能力有关,各种外界因素如饲喂时间、季节等周期性因素和环境微生物对瘤胃菌群的影响也不容忽视。本研究基于3头安装有瘤胃瘘管的杂交水牛,在4个不同季节分别采集瘤胃样品(饲喂前0h、饲喂后2h)和各种环境样品(土壤、饲料、粪便、垫料),通过对各类样本细菌16S r RNA基因V3-V4区进行测序分析,探究在舍饲条件下,不同季节瘤胃菌群结构的变化规律、环境关联性及木质纤维素降解微生物的丰度、环境关联性和对木质纤维的降解能力,为水牛耐粗机理的深入研究奠定基础,主要结果如下:(1)水牛瘤胃菌群的季节波动性:不同季节间瘤胃菌群丰度具有波动性,且差异极显著(p<0.001),在门水平上,春季和冬季纤维杆菌门(Fibrobacteres)的相对丰度极显著高于夏季和秋季(p<0.01),春季变形菌门(Proteobacteria)的丰度极显著高于其它季节(p<0.001),其它菌门也存在相对丰度的季节动态变化,在属水平上,春季理研菌科RC9菌群(Rikenellaceae＿RC9＿gut＿group)的相对丰度显著低于夏季和秋季(p<0.05),夏季瘤胃菌科UCG-011菌群(Ruminococcaceae＿UCG-011)的相对丰度显著高于春季和秋季(p<0.05),春季和冬季纤维杆菌属(Fibrobacter)的丰度极显著高于夏季和秋季(p<0.01),其它优势菌属在不同季节也出现较大的丰度差异;饲喂周期内不同时间瘤胃菌群多样性和丰富度差异不显著(p>0.05)。(2)瘤胃菌群的环境关联性:瘤胃样本与土壤、饲料、粪便、垫料共享的OTU数量分别为4617、3835、3577、3547,分别占瘤胃总OTU数目的39.69%、32.97%、30.75%和30.49%,微生物物种重合较多,菌群多样性相似程度很高;在菌群结构与进化关系上与瘤胃最相近的是粪便,其次是饲料。(3)水牛瘤胃菌群功能分析:对水牛瘤胃菌群进行功能预测,结果表明瘤胃微生物功能集中在氨基酸运输及代谢、碳水化合物转运及代谢等相关基因上,瘤胃中具有蛋白转运、代谢以及纤维素、木质素降解相关功能的微生物含量丰富。(4)水牛瘤胃中降解木质素菌株与环境的关联性:基于上述功能预测的结果,利用木质素唯一碳源培养基,从水牛瘤胃中分离出具有降解木质素功能的1株真菌横梗霉菌(F9)和大肠杆菌(B20)、环状芽孢杆菌(B36)、地衣芽孢杆菌(B44、B46)和短小芽孢杆菌(B58)5株细菌,选择产酶能力强、生长良好的B58作为试验菌开展后续研究;这5株细菌可被聚类到环境样本测序数据的4个OTU中,这些在瘤胃中定植的微生物,可能来自外源环境。(5)B58的生物学特性和益生潜力:B58可在p H 6.5-9.0条件下迅速生长,对木质素磺酸钠和稻草纤维素7d的降解率为5.44%和9.29%,在产酶培养基中发酵5d,产酸使培养基p H降至5.6,产木质素锰过氧化物酶的最大酶活为1.47U/m L,产纤维素降解酶的酶活为3.69 U/m L;其基因组中未检测到10种常见毒力基因,在25种常见抗生素中,仅对头孢噻肟等6种抗生素有耐药性,对古霉素等12种抗生素敏感,对猪小肠上皮细胞IPEC-J2的粘附率为4.32%,可耐受p H值为2.0、胆盐浓度为0.30%的环境。综上所述:不同季节间瘤胃菌群丰度显著极差异,饲喂周期内不同采样时间瘤胃菌群差异不显著,瘤胃与粪便,饲料等环境间存在较强的物种多样性关联。菌群功能预测发现瘤胃中含有丰富的降解木质纤维素类微生物,从瘤胃中分离的6株菌株均验证了此功能,且这些菌株与外界环境存在遗传关联。选择其中产酶能力强的短小芽孢杆菌B58进一步研究发现,该菌株能够降解木质素和纤维素,有较高的产锰过氧化物酶和纤维素酶能力,安全性高,抗逆性强,具备作为益生菌开发的潜力。