目的:构建特异性增殖细胞核抗原（PCNA）的siRNA真核表达载体并转染人肝癌HepG2细胞,以探讨重组质粒对HepG2细胞体外增殖及生物学特性的影响,为进一步探索PCNA基因功能,RNA干扰（RNAi）分子靶向基因治疗肝癌提供一种新的手段和理论基础。方法:1.在我们的前期工作中,已经利用体外转录合成的双链小干扰RNA（small interferingRNA,siRNA）筛选出了靶向PCNA基因的最佳RNA干扰作用位点,本研究以此为基础将筛选出的最佳siRNA序列转化为能表达其小发夹结构RNA（small hairpin RNAs,shRNA）的DAN序列,并与pSilencer2.0-U6质粒定向连接,构建特异性增殖细胞核抗原（PCNA）的siRNA真核表达载体pShPCNA,通过DNA测序进行鉴定。2.通过脂质体LipofectamineTM 2000介导的,特异性真核表达载体pShPCNA和表达绿色荧光蛋白质粒pEGFP（pShPCNA与pEGFP质量比为2:1）共同瞬时转染人肝癌HepG2细胞36 h,检测特异性真核表达载体pShPCNA转染人肝癌HepG2细胞的转染效率。3.RT-PCR半定量法检测特异性真核表达载体pShPCNA对HepG2细胞PCNA mRNA表达的影响。4.WST-8法检测特异性真核表达载体pShPCNA对HepG2细胞增殖的影响。5.克隆形成抑制检测pShPCNA对HepG2细胞克隆形成的影响。6.划痕实验来观察pShPCNA对HepG2细胞迁移力的影响。7.PI单染流式细胞仪检测pShPCNA对HepG2细胞周期以及亚二倍体率的影响。8.Annexin V-PI双染测定pShPCNA对HepG2细胞早期凋亡率的影响。9.细胞线粒体膜电位检测pShPCNA对HepG2细胞线粒体膜电位的变化。10.Hoechest 33258染色观察pShPCNA对HepG2细胞凋亡形态学变化。结果:1.成功构建特异性增殖细胞核抗原（PCNA）的siRNA真核表达载体pShPCNA,经DNA测序证实与设计完全一致。2.特异性真核表达载体pShPCNA与表达绿色荧光蛋白质粒pEGFP共同瞬时转染HepG2细胞36 h,流式细胞仪检测表达绿色荧光蛋白的HepG2细胞在所有细胞中的比例为64.4%。3.pShPCNA转染HepG2细胞48 h后,RT-PCR半定量分析PCNA mRNA表达结果显示:转染组细胞PCNA mRNA表达明显下调。4.pShPCNA转染HepG2细胞48 h后,WST-8法检测显示:转染组细胞出现明显的增殖抑制作用。5.pShPCNA转染HepG2细胞48 h后,克隆形成抑制实验结果显示:pShPCNA能明显抑制HepG2细胞克隆的形成。6.pShPCNA转染HepG2细胞48 h后,划痕实验结果显示:pShPCNA能明显抑制HepG2细胞的迁移力。7.pShPCNA转染HepG2细胞48 h后,PI单染流式细胞仪检测细胞周期发现:转染组细胞明显阻滞于G0/G1期。8.pShPCNA转染HepG2细胞48 h后,PI单染实验检测转染组出现明显的亚二倍体凋亡峰;Annexin V-PI双染实验检测转染组细胞出现明显的早期凋亡细胞群。9.pShPCNA转染HepG2细胞48 h后,细胞线粒体膜电位检测显示:转染组细胞出现线粒体膜电位的改变。10.pShPCNA转染HepG2细胞48 h后,Hoechest 33258染色可见:转染组细胞胞核固缩、边聚和裂解、凋亡小体形成等凋亡形态学变化。结论:1.成功构建特异性增殖细胞核抗原（PCNA）的siRNA真核表达载体pShPCNA,经DNA测序证实与设计完全一致。2.pShPCNA转染HepG2细胞48 h后,能够显著抑制细胞的生长增殖,诱导细胞凋亡,细胞周期阻滞于G0/G1期以及出现线粒体膜电位的变化。