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目的:由于各种意外伤害和颅骨病变所导致的颅骨缺损严重影响患者的生活,甚至会有生命危险,目前临床仍无满意的治疗方法。近年来,随着干细胞治疗的发展,为大面积颅骨缺损修复带来了希望。本实验室发现人牙周膜干细胞(h PDLSC)在TGF-β3作用下表现出更强的成骨分化性能,在此基础上应用新型类人I型胶原(RHC)/壳聚糖(CS)冻干海绵作为载体,进行h PDLSC联合TGF-β3冻干海绵移植修复大鼠颅骨临界尺寸骨缺损的实验研究,并探讨其分子机制。为骨缺损修复的干细胞治疗研究提供一种全新的搭配,给临床提供数据参考。方法:(1)通过组织块-酶消化联合法提取h PDLSCs,利用流式细胞术鉴定其表型、多向分化实验验证其干性。细胞迁移实验研究TGF-β3招募细胞的作用。通过碱性磷酸酶(ALP)活性测定及矿化实验研究TGF-β3诱导对h PDLSCs成骨分化的影响;WB检测COL I、COL II、ALP、TGF-βRI、TGF-βRII、Runx2、p-P38和P38的表达变化研究TGF-β3诱导h PDLSCs成骨分化的分子机制。(2)通过真空冷冻干燥和浸泡吸附法制备得到不同CS含量的TGF-β3/RHC/CS(TRC)冻干海绵。通过扫描电镜(SEM)、乙醇置换实验、压缩性能测试、体外降解实验、水蒸气透过实验、吸水性测试及保湿性实验对比不同CS含量制备的TRC冻干海绵的微观结构、孔隙率、力学性能、降解性、物质交换能力、吸水性及保湿性,从中优选出适宜后续实验的TRC冻干海绵。(3)SEM、MTT和Calcein-AM/PI染色检测TRC冻干海绵细胞相容性。皮下埋植实验研究TRC冻干海绵的组织相容性及降解性。CM-Dil标记法观察h PDLSCs在大鼠体内存活。通过CCK-8和ALP活性检测,研究h PDLSCs在TRC冻干海绵增殖及成骨分化性能。建立大鼠颅骨临界尺寸缺损模型进行h PDLSCs联合TGF-β3冻干海绵移植体内药效学研究。通过Mirco-CT扫描、HE&Masson染色观察颅骨缺损部位修复情况,利用免疫组织染色研究COL I、Runx2和BMP-2的表达情况。结果:(1)提取的h PDLSCs具备干细胞多向分化特性。间充质干细胞标志物CD44、CD90、CD105和CD166分别为99.7%、99.8%、98.9%和99.5%,造血干细胞标志物CD34、CD45和HLA-DR呈阴性表达。TGF-β3不影响h PDLSCs的正常生长,但促进了h PDLSCs迁移。ALP活性测试及茜素红染色结果显示:TGF-β3(20 nmol/L)诱导14天后显著提高了h PDLSCs的ALP活性(P<0.01,vs Control);诱导21、28天后,显著促进了h PDLSCs的矿化沉积(P<0.01,vs Control)。WB测试发现TGF-β3诱导后h PDLSCs的COL I、ALP、Runx2、TGF-βRI、TGF-βRII和p-P38/t-p38蛋白表达提高。(2)1%TRC冻干海绵皱缩无立体结构,而2%、3%TRC冻干海绵能形成多孔立体结构。3%TRC冻干海绵力学性能最好,但2%TRC冻干海绵具有更好的体外降解性、吸水性、物质交换能力及保湿性。(3)TRC冻干海绵具有较好的生物相容性。TRC冻干海绵在大鼠皮下埋植90天后基本降解完全。皮下埋植21天,大鼠体内仍然可以观察到CM-Dil荧光标记的h PDLSCs细胞。TRC冻干海绵浸提液无论是进行细胞培养,还是大鼠腹腔注射均未观察到毒性反应。CCK-8实验和ALP活性检测表明h PDLSCs在TRC冻干海绵(TRC-h)上能够生长增殖及成骨分化(P<0.05,vs Control)。h PDLSC联合TGF-β3冻干海绵移植大鼠颅骨临界尺寸骨缺损部位12周,发现植入部位有新生组织填充,而模型组仅观察到一层透明薄膜。Miroc-CT结果表明TRC-h组相较于其他组,骨缺损面积显著缩小(P<0.01)。HE及Masson染色结果显示,TRC-h组骨缺损内有大量组织填充,可见大量且厚的新生骨组织生成。免疫组化观察到TRC-h组冻干海绵周围细胞的成骨相关蛋白Runx2、BMP-2和COL I表达显著高于其他各组。结论:(1)获得纯度高,具有多向分化能力的h PDLSCs。TGF-β3促进h PDLSCs迁移且不影响其增殖。TGF-β3显著促进h PDLSCs早期成骨分化活性及晚期钙沉积作用。TGF-β3通过提高h PDLSCs成骨相关蛋白的表达促进h PDLSCs成骨分化作用。(2)2%CS含量的TRC冻干海绵具有较好的理化性能。TRC冻干海绵具有良好的生物相容性、骨诱导性及合适的体内降解速率。种植在TRC冻干海绵上的h PDLSCs能够在大鼠体内存活至少21天。h PDLSCs联合TRC冻干海绵促进了大鼠颅骨临界尺寸骨缺损部位骨新生。TGF-β3可能是通过P38为靶点的信号转导诱导了h PDLSCs的成骨分化。