陆地棉长链非编码RNA-lncRNA973及其启动子功能分析

来源 :山东农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zhhc1987
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棉花是世界上重要的经济作物之一,其生长过程容易受到多种逆境胁迫。虽然棉花具有较强的耐盐性,但长期以来盐胁迫仍是影响棉花生长发育,限制棉花产量和品质的重要因素。长链非编码RNA(long noncoding RNAs,lncRNAs)是一类功能性RNA分子,在生物体内以RNA分子的形式从多个水平参与不同生物学进程的调控,具有调节植物生长发育和增强植物抗逆性的生理作用,目前在棉花中仅有少数关于lncRNA逆境调节功能的报道。本课题组前期通过转录组测序鉴定到陆地棉盐胁迫相关的lncRNAs,并通过病毒诱导的基因沉默(VIGS)和拟南芥异源过表达验证了陆地棉lncRNA973参与调控植物耐盐性。但盐胁迫下过表达lncRNA973在棉花中的功能和lncRNA973响应盐胁迫信号的途径尚不清楚。本研究以陆地棉盐敏感品种华棉一号(HM-1)为研究材料,通过遗传转化获得过表达lncRNA973植株和盐胁迫下生长生理指标检测,验证了过表达lncRNA973正向调控陆地棉耐盐性;通过对lncRNA973启动子分析鉴定了lncRNA973启动子中参与响应盐胁迫的顺式作用元件。主要研究结果如下:1、通过农杆菌介导的遗传转化将lncRNA973过表达载体导入盐敏感陆地棉品种HM-1。以无菌苗下胚轴为外植体诱导愈伤组织,愈伤组织经农杆菌侵染后置于卡那霉素选择培养基上进行筛选,并通过连续继代和诱导生根获得再生转基因幼苗。利用PCR检测转化再生植株中选择标记基因NptⅡ,确定其中25棵再生植株为过表达lncRNA973陆地棉阳性植株。荧光定量PCR分析表明,lncRNA973在阳性再生植株中的相对表达量均显著提升。2、过表达lncRNA973缓解陆地棉盐胁迫。通过比较盐处理(250 mM NaCl)下陆地棉植株生长情况发现,过表达lncRNA973缓解了盐胁迫对HM-1造成的生长抑制,提高了HM-1耐盐性。盐胁迫下HM-1和过表达lncRNA973植株生理指标检测结果表明,过表达lncRNA973提升了盐胁迫下陆地棉幼苗体内相对含水(RWC),叶绿素(Chlorophyl)、脯氨酸(Pro)、可溶性糖(SS)和还原型谷胱甘肽(GSH)含量,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性,维持了盐胁迫陆地棉的代谢水平、渗透调节能力和活性氧清除能力,从而缓解了盐胁迫对陆地棉造成的生长抑制,进而提高棉花的耐盐性。3、陆地棉lncRNA973启动子功能分析。从陆地棉中克隆到lncRNA973启动子(P_lncRNA973)全长序列,根据各顺式作用元件在P_lncRNA973上的位置,构建不同长度的P_lncRNA973融合GUS基因的表达载体,并稳定转化拟南芥,并通过GUS组织化学染色,分析了拟南芥转化体系中各P_lncRNA973片段的活性。通过启动子活性分析我们发现,P_lncRNA973中活性最高的区域是位于3’端P2和P1之间(-247 bp~-153bp)的短片段,该区域可能负责调控lncRNA973在特定环境中基本的组成型表达;P3和P2之间(-342 bp~-247 bp)存在抑制型调控元件,具有较强的负调控特性;P8和P6之间(-828 bp~-581 bp)存在激活型调控元件;P15和P14之间(-1536 bp~-1429 bp)的启动子片段中的盐诱导型顺式作用元件MYCATERD1识别位点(-1525 bp~-1519 bp)可能是赋予P_lncRNA973盐诱导活性的关键顺式作用元件。
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