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水稻条纹病毒（Rice stripe virus,RSV）由灰飞虱（Laodelphax striatellus,灰飞虱）以持久循回增殖的方式传播,并在亚洲国家造成了严重的水稻减产。RSV是典型的Tenuivirus属单链RNA病毒,现有的研究表明介体灰飞虱中RSV主要在细胞质复制。然而,在烟草中的研究发现RSV编码的蛋白NS3、NP和SP在细胞核中有定位信号,表明植物体内RSV在复制过程中,其编码的蛋白可能进入细胞核。本论文以RSV以及其介体昆虫灰飞虱为研究对象,阐明了RSV NS3蛋白劫持灰飞虱泛素系统入核调节miRNA以促进自我复制的机制。主要成果如下:1 RSV侵染引起灰飞虱泛素系统相关基因上调表达利用 RT-PCR 和 cDNA 末端快速扩增技术（Rapid amplification of cDNA ends,RACE）获得灰飞虱泛素基因（LsUb）序列（GenBank accession no.MW76799）、灰飞虱RING型泛素连接酶基因（LsE3-RING）序列（GenBank accession no.MW751455）和灰飞虱HECT型泛素连接酶基因（LsE3-HECT）序列（GenBank accession no.MW767162）。通过 RT-qPCR 和 Western blot（WB）分析这三个基因在带毒与不带毒灰飞虱体内的表达差异。结果显示与不带毒灰飞虱相比,带毒灰飞虱中LsUb和LsE3-RING mRNA和蛋白水平显著升高,然而LsE3-HECT相对表达水平却没有显著变化,此外,使用泛素抗体进行的WB实验检测发现RSV的侵染显著提高了灰飞虱体内蛋白的泛素化水平。进一步研究表明,LsUb的表达水平在带毒灰飞虱的中肠和唾液腺中显著升高,分别比不带毒灰飞虱的表达水平上调176%和84%,但在卵巢中差异不显着;LsE3-RING表达水平在带毒灰飞虱的卵巢、中肠和唾液腺中均显著上调,并且在中肠中上调最为显著（上调330%）,其次是唾液腺（上调123%）和卵巢（上调112%）;相比之下,RSV的侵染不影响LsE3-HECT在各组织中的转录水平。进一步使用RNAi技术沉默LsE3-RING,检测其对带毒灰飞虱体内RSV积累的影响,结果显示dsLsE3-RING处理显著减少灰飞虱体内总蛋白以及各组织（卵巢、中肠和唾液腺）蛋白的泛素化水平和RSV载量,并且发现中肠内蛋白的泛素化水平和RSV载量下调水平最为显著。通过激光共聚焦显微镜观察到LsE3-RING的沉默减少灰飞虱卵巢、中肠和唾液腺中RSV粒子的积累。这些结果表明LsE3-RING介导的泛素化在RSV积累中起着关键作用。2 LsE3-RING介导了 RSV NS3的K63位泛素化通过酵母双杂交和GST pull-down技术筛选并验证了LsE3-RING与RSV NS3的直接相互作用,接着通过构建不同截断体和突变体进一步发现LsE3-RING与RSV NS3的互作位点位于NS3蛋白的第65-67位和第74-76位氨基酸处。体外泛素实验也证明RSV NS3是LsE3-RING的泛素化底物,并且为K63位泛素化修饰。通过比较dsLsE3-RING+MG132（26S蛋白酶体抑制剂）、MG132+DMSO和dsGFP+DMSO处理的带毒灰飞虱体内RSV载量和RSV NP蛋白水平的变化,发现与对照组（dsGFP+DMSO双处理）和MG132+dsGFP双处理组相比,MG132+dsLsE3-RING双处理使带毒灰飞虱中的RSV载量和RSV NP蛋白水平显著降低。这些结果表明LsE3-RING介导的RSV NS3泛素化对RSV积累的影响并不依赖于26S蛋白酶体。3 LsE3-RING介导的RSV NS3泛素化促进NS3核转运通过免疫荧光共聚焦观察发现RSV NS3在带毒灰飞虱和获毒灰飞虱细胞内具有核定位能力,并且RSV NS3通常与LsE3-RING和LsUb共定位在细胞核周围。通过RNAi沉默带毒灰飞虱LsE3-RING以及在Sf9细胞过表达LsE3-RING蛋白,明确了 LsE3-RING介导的泛素化对RSV NS3的核转运具有重要作用。通过激光共聚焦显微镜观察发现沉默LsE3-RING后RSV NS3核定位明显减少,提取细胞核蛋白进行的Western blot也发现核内RSV NS3蛋白减少;与之相反的是,相较于过表达eGFP的Sf9细胞,LsE3-RING的过表达使得RSV NS3大量进入细胞核中并且核内RSV NS3蛋白水平较高,此外,RT-qPCR检测发现过表达LsE3-RING的Sf9细胞内病毒载量较高,并且不同细胞组分的western blot试验结果显示,过表达LsE3-RING的Sf9细胞的细胞核中的NS3含量比对照组高。接着使用RSV侵染过表达LsE3-RING的Sf9细胞来探索RSV NS3入核时间规律,结果表明,在病毒侵染的7-11.5 h内,RSVNS3蛋白没有定位于细胞核中,在加入RSV粒子12.5 h后,RSV NS3开始进入细胞核,并且侵染13-21 h之间细胞核中RSV NS3蛋白含量逐渐上升,在RSV侵染17 h和21h后,分别在30和85%的细胞核中检测到NS3荧光信号,在RSV侵染21.5 h以后,细胞核内RSV NS3含量处于相对平稳阶段。接着收集四组不同龄期的带毒灰飞虱样本研究RSVNS3在灰飞虱体内的亚细胞定位,免疫荧光和不同细胞组分的western blot检测发现,四组样本中肠细胞核中RSV NS3蛋白含量并无显著差异。此外,通过免疫荧光实验还观察到LsUb和RSV NS3的定位涉及四种空间模式,即胞质中,核周共定位,核内共定位以及大量充斥于细胞核中。以上研究表明LsE3-RING介导的泛素化对RSV NS3的核转运有至关重要的作用。4 RSV NS3入核介导miRNA加工促进病毒复制对带毒与不带毒灰飞虱的小RNA组进行测序,筛选获得6个上调表达的miRNA和10个下调的miRNA。通过qPCR定量验证这16个差异表达miRNA在带毒与不带毒灰飞虱虫体内的差异表达水平,结果表明其中4 个miRNA（lst-miR-92、lst-miR-36、lst-miR-8-5p 和 lst-miR-275a-5p）上调,1 个 miRNA（lst-miR-79）下调。由于RSV NS3在病毒复制过程中会定位于细胞核,并且细胞核是miRNA初级转录产物（pri-miRNA）的加工场所,因此进一步测定这5个miRNA的初级转录产物在带毒与不带毒灰飞虱体内的差异表达以确定RSV感染是否通过促进pri-miRNA加工从而增加这些miRNA的积累水平。结果显示,RSV感染下调灰飞虱体内 pri-miR-92、pri-miR-3 6 和 pri-miR-276a-5p 的水平,而 pri-miR-8-5p 和 pri-miR-79没有显著变化,并且RNA免疫共沉淀结果表明RSVNS3可以识别pri-miR-92和pri-miR-36。进一步通过CoIP和免疫荧光共聚焦检测发现RSV NS3可以与灰飞虱微处理器复合体（Microprocessor）的重要组分Drosha直接互作。以上研究表明NS3在细胞核的pri-miRNA的加工过程中起到重要作用。通过RNAi沉默LsE3-RING以检测LsE3-RING对上述5个差异表达miRNA的表达调控,结果显示lst-miR-92下调水平最显著。为了明确lst-miR-92在RSV复制中的作用,首先向带毒灰飞虱分别注射lst-miR-92 mimic和lst-miR-92 inhibitor,接着检测体内不同时间RSV复制相关基因—RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）的变化。结果表明,带毒灰飞虱体内的RSV RdRp转录水平在lst-mR-92 mimic处理2天和4天后分别上调了 206%和195%,而处理6天后无显著差异;lst-miR-92 inhibitor处理2天和4天后灰飞虱中RSV RdRp转录水平分别降低了67%和51%,同样在处理6天后恢复到对照水平。随后检测注射lst-miR-92 mimic和lst-miR-92 inhibitor后对灰飞虱体RSV载量的影响。RT-qPCR结果表明,与对照（mimic-NC 或 inhibitor-NC）相比,lst-miR-92 mimic 处理 2 天、4 天和 6 天后,灰飞虱体内RSVNP转录水平分别上调了 207%、83%和59%;lst-miR-92 inhibitor处理2天、4天和6天后灰飞虱体内RSV NP转录水平分别降低了 76%、61%和42%。Western blot实验结果表明,lst-miR-92 mimic处理2天、4天和6天后的灰飞虱体内病毒NP蛋白水平均高于对照组,而lst-miR-92 inhibitor处理2天、4天和6天后灰飞虱体内病毒NP蛋白水平均低于对照组。进一步通过免疫荧光共聚焦观察lst-miR-92对带毒灰飞虱中肠中病毒聚集的影响,结果再次表明lst-miR-92增加了灰飞虱体内RSV的载量。使用miRanda、PITA和RNAhybrid预测lst-miR-92的靶基因,共发现81个lst-miR-92候选靶基因。lst-miR-92很可能通过这些靶基因参与了RSV复制。以上研究表明受RSV NS3入核调控的lst-miR-92在RSV复制中起到重要作用。综上所述,LsE3-RING催化了 RSV非结构病毒蛋白NS3的K63泛素化,NS3的泛素化促进了 NS3从细胞质向细胞核的易位。在细胞核中,NS3通过操纵微处理器复合体来调节pri-miR-92的加工,从而诱导lst-miR-92的积累。最后,lst-miR-92通过靶基因促进了 RSV复制。这项研究为通过调控宿主昆虫中的泛素和miRNA来管理植物病毒提供了的新途径。