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第一部分：甲基莲心碱对小鼠血小板的作用及抗血栓作用的研究 目的:血小板在形成病理性血栓,引发中风,诱发动脉粥样硬化等心脑血管疾病过程中发挥着重要作用。本研究旨在观察甲基莲心碱对小鼠血小板的聚集、黏附、解聚及抗血栓作用的影响。 方法:本部分实验下腔静脉抽取小鼠血液,分离出PRP或制成洗涤血小板,利用比浊法测定甲基莲心碱对胶原、凝血酶、ADP和U46619诱导的血小板聚集的抑制作用,同时也观察甲基莲心碱对胶原、凝血酶、ADP和U46619诱导的已聚集血小板的解聚作用;由于血小板颗粒释放的量同荧光强度正相关,由此测定甲基莲心碱对胶原、凝血酶和U46619诱导血小板聚集时释放的作用;利用体外血栓实验观察甲基莲心碱对血小板在体外形成血栓的影响;利用急性肺血栓模型观察甲基莲心碱对小鼠体内血栓形成的抑制作用。 结果:①5min内,3μMNef能抑制胶原、凝血酶、U46619和ADP诱导的血小板聚集,并能使胶原、ADP和U46619诱导的已聚集的血小板解聚;1μMNef能完全抑制胶原诱导的血小板聚集,能明显使胶原、ADP和U46619诱导的已聚集的血小板解聚;0.3μMNef均不能完全抑制凝血酶及U46619诱导的血小板聚集,亦不能使胶原、凝血酶、ADP和U46619诱导的已聚集的血小板发生解聚现象。②0.3μMNef、1μMNef、3μMNef能明显抑制胶原、凝血酶和U46619诱导的血小板释放。③在体外血栓实验中,0.3μMNef、3μMNef均能明显减少血小板黏附面积,与阳性药阿司匹林组相比,3μMNef能明显减少血小板黏附面积。④在甲基莲心碱对小鼠急性肺血栓的影响实验中,与模型组相比,3mg/kgNef和6mg/kgNef均能使小鼠的死亡率降低;免疫组化结果显示:与模型组相比,阿司匹林组和6mg/kgNef组的血栓形成明显减少。 结论:甲基莲心碱能明显抑制小鼠的血小板聚集和释放,亦可使已聚集的血小板解聚,能明显抑制小鼠血小板体外的黏附和血栓的形成,能明显减少小鼠急性肺血栓模型中的血栓形成。 第二部分：甲基莲心碱对正常人血小板的作用研究 目的:为了进一步研究甲基莲心碱对血小板的相关作用,本实验采用人血小板进行研究,观察其对人血小板的相关作用,并试图寻找其抗血小板及抗血栓作用的相关作用机制。 方法:本部分实验取人上臂肘静脉抽取血液,分离出PRP或制成洗涤血小板,利用比浊法测定甲基莲心碱对胶原、凝血酶、ADP、U46619和Adr诱导的血小板聚集的抑制作用;同样利用比浊法观察甲基莲心碱对胶原、凝血酶、ADP、U46619和Adr诱导的已聚集血小板的解聚作用;用固定的胶原蛋白和纤维蛋白原同血小板相作用,同时观察甲基莲心碱对血小板黏附及扩展的影响;利用体外血栓实验观察甲基莲心碱对血小板在体外形成血栓的影响;用流式细胞术观察甲基莲心碱对预先孵育血小板和对已活化血小板的P-选择素的表达、PAC-1的表达和同纤维蛋白原结合的影响;采用WesternBlot实验方法,观察不同时间点胶原诱导血小板聚集时甲基莲心碱对PI3Kp85、Akt、PI3Kp110、GSK3β、p38MAPK、PKC、PLCγ2、Syk、JNK、ERK、eNOS和VASP蛋白磷酸化的影响。 结果:①5min内,3μMNef均能明显抑制胶原、凝血酶、U46619、ADP和Adr诱导的血小板聚集和已聚集的血小板解聚,1μMNef能明显抑制胶原、凝血酶、U46619、ADP和Adr诱导的血小板聚集,并能明显使ADP、凝血酶和Adr诱导的已聚集的血小板解聚,0.3μMNef能明显抑制胶原、U46619、ADP和Adr诱导的血小板聚集,但均不能使ADP、胶原、凝血酶、U46619和Adr诱导的已聚集的血小板发生解聚现象。②在体外黏附实验中,3μMNef、1μMNef使血小板黏附数量、黏附面积均明显减少;在体外扩展实验中,3μMNef使血小板黏附数量和面积均明显减少,1μMNef使血小板黏附数量减少。③体外血栓实验中,3μMNef能明显减少血小板黏附面积。④当甲基莲心碱预处理血小板后,3μMNef能使P-选择素、PAC-1表达降低,并减少纤维蛋白原的结合,0.3μMNef能使PAC-1的表达降低;甲基莲心碱作用于已活化的血小板时,3μMNef和0.3μMNef能使PAC-1的表达降低,但仅3μMNef减少纤维蛋白原的结合,Nef对P-选择素的表达无影响。⑤WesternBlot结果显示,甲基莲心碱抑制胶原诱导的血小板聚集实验中,反应30s时能明显抑制p-AKT、p38MAPK的活性,反应300s时能明显抑制PI3Kp85、p-GSK3β的活性,反应30s和300s时均能明显抑制PKC的活性,对PI3Kp110、p-PLCγ2、p-Syk、p-JNK、p-ERK、p-eNOS和p-VASP的活性没有影响;甲基莲心碱对胶原诱导的血小板解聚实验中,反应300s能明显抑制PI3Kp85、p-AKT、p-GSK3β、p38MAPK和PKC的活性,对PI3Kp110、p-PLCγ2、p-Syk、p-JNK、p-ERK、p-eNOS和p-VASP的活性没有影响。 结论:甲基莲心碱能明显抑制人的血小板聚集,亦能使已聚集的血小板解聚,能明显抑制人血小板体外的黏附、扩展和血栓的形成,其抗血栓作用机制可能与抑制P-选择素的活性、抑制αIIbβ3与纤维蛋白原的结合、抑制血小板内PI3K-Akt-GSK3β/p38MAPK和PKC信号转导通路相关。