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目的：利用Caco-2肠上皮细胞单层屏障模型研究四种肠道微生物对肠道屏障的影响。方法：建立Caco-2肠上皮细胞单层屏障模型，碱性磷酸酶检测细胞极性。将实验分为空白对照组、大肠埃希菌组、肺炎克雷伯菌组、粪肠球菌组、乳酸杆菌组，在各组细菌作用下，Millicell-ERS电阻测定仪测定Caco-2肠上皮细胞单层跨上皮细胞电阻TEER值变化、酶标仪检测荧光黄通过率的变化；酶联免疫吸附法（ELISA）检测单层细胞zonulin；电镜观察细胞间紧密连接超微结构变化；免疫荧光、Westernblot方法检测紧密连接（TJ）相关蛋白Occludin、Claudin-1、ZO-1表达、分布和超微结构变化。所有数据采用均数标准差表示，P＜0.05认为差异有统计学意义，采用SPSS17.0统计软件进行统计分析。结果：碱性磷酸酶测定细胞单层呈明显极性，TEER值稳定在250㎝2，建模成功；肠道大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌均引起细胞单层屏障通透性升高，TEER值明显下降，荧光黄透过率增高，与对照组相比较差异显著（P＜0.01）；大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌作用后细胞释放zonulin蛋白增加，与对照组相比有统计学差异（P＜0.01），粪肠球菌作用于Caco-2细胞单层后，zonulin释放量较对照组升高，但差异无统计学意义（P＞0.05），乳酸杆菌组zonulin释放量与对照组无显著差异（P＞0.05）；大肠埃希菌与单层细胞作用6小时后透射电子显微镜观察单层细胞屏障可见细胞表面微绒毛变稀，绒毛有脱落，细胞间紧密连接电子密度降低，断裂，间隙增宽；大肠埃希菌组、肺炎克雷伯菌组三种紧密连接蛋白Occludin、Claudin-1、ZO-1表达明显减少。粪肠球菌组、乳酸菌组Occludin、Claudin-1表达与空白对照组相比无明显变化，胞浆蛋白ZO-1表达降低。细菌作用6小时后免疫荧光观察紧密连接蛋白分布情况，大肠埃希菌组和肺炎克雷伯菌组可见荧光较正常组松散，不连续，可见明显锯齿状分布，甚至缺口及裂隙样表现，荧光强度减弱，粪肠球菌组、乳酸菌组荧光强度稍减弱，但仍沿胞膜分布，条带较清晰，与空白对照组差异不明显。结论：1.建立稳定的Caco-2单层细胞屏障模型；2.肠道四种微生物中，大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌不同程度引起单层细胞完整性的损害，乳酸杆菌无此作用；3.大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌引起肠上皮细胞分泌zonulin增加；4.大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌通过降低紧密连接蛋白表达、改变其分布影响损伤肠道屏障功能。