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目的:线粒体是机体能量代谢的动力工厂,高耗能器官如骨骼肌、心脏、中枢神经系统、内分泌系统、视网膜和肝脏等易受线粒体功能的影响[5,6]。由于线粒体几乎不含对自身进行修复的监控系统,因此易发mt DNA突变[4],导致线粒体功能缺陷或障碍,引起线粒体病如心脏病、糖尿病,衰老和卵巢功能减退等[8]。本课题组具备线粒体功能障碍模型鼠Fus1 KO鼠使用权,因此,研究线粒体功能障碍模型鼠Fus1 KO鼠的卵巢储备功能,证实其具有卵巢功能减退表型,可以为线粒体功能障碍导致卵巢储备功能减退的机制研究提供数据支撑,同时也进一步拓宽Fus1 KO模型鼠的应用范畴。另外线粒体置换技术（Mitochondrial replacement techniques,MRT）被认为可能是目前唯一阻断线粒体遗传病代际传播的有效途径。纺锤体移植技术因其不涉及卵母细胞体外成熟培养,纺锤体周围无核膜包绕,取出含细胞核胞体携带残余突变线粒体少,优势明显。研究发现,电融合纺锤体移植技术构建重构卵易发染色体异常可能与电融合电刺激有关,而病毒融合对卵胞体刺激较小,因此本研究拟应用病毒融合纺锤体移植（Spindle transfer,ST）技术,检测纺锤体组装调控关键蛋白Bub1相关激酶（Bubl related kinase,Bub Rl）和第五天囊胚的染色体核型,比较取核前后对纺锤体组装关键蛋白Bub R1定位,纺锤体形态,染色体排列和分布以及胚胎发育的影响。为纺锤体移植技术对线粒体遗传病治疗过程中存在的安全性问题提供可靠的实验依据。方法:模型来源及意义:本实验用到的线粒体功能障碍小鼠模型来源于上海市耳鼻疾病转化医学重点实验室;在此模型小鼠中,敲除基因Fus1后,Fus1蛋白丢失。Fus1蛋白主要与线粒体功能有关。由于线粒体蛋白Fus1的丢失,导致线粒体膜电位,钙摄取,呼吸储备,线粒体融合等参数的改变,造成线粒体功能障碍。1.Fus1 KO小鼠卵巢储备功能研究的方法1.1通过眼球取血法分别采取野生型（Wild type,WT）小鼠和Fus1KO小鼠的眼球血,化学发光法定量测定血清中的孕激素（Progesterone,P）,雌二醇（Estradiol,E2）,抗缪勒管激素（Anti mullerian hormone,AMH）水平。1.2将野生型（WT）小鼠和Fus1 KO小鼠分别脱臼处死,称取小鼠体重,快速地找到双侧卵巢,把卵巢周围的脂肪组织钝性分离后,将双侧的卵巢取出,称取卵巢的重量。1.3将卵巢组织进行HE染色,观察卵巢的组织形态并统计初级卵泡和次级卵泡数目。2.病毒融合纺锤体移植对重构胚发育,纺锤体组装,染色体的排列与分布影响研究的方法2.1通过体外受精观察对照组和病毒融合后重构卵组的胚胎发育情况,分别统计两组小鼠卵的受精率、卵裂率、囊胚率、孵化率。2.2免疫荧光化学法检测病毒融合纺锤体移植取核前,取核后和融合后纺锤体组装关键蛋白Bub Rl的定位,纺锤体形态,染色体排列与分布,统计Bub R1定位正常率、纺锤体形态正常率、染色体未分离率。2.3将对照组和病毒融合后重构卵组进行体外受精后,检测对照组和病毒融合后重构卵组第五天囊胚染色体核型是否异常,统计染色体核型异常率。结果:1.Fus1 KO小鼠卵巢储备功能的研究1.1将8周龄、12周龄、20周龄、68周龄、74周龄的Fus1 KO小鼠和WT小鼠的体重和卵巢的重量进行比较,发现实验组和对照组之间没有显著统计学差异（P＞0.05）;1.2检测8周龄、12周龄、20周龄、68周龄、74周龄的Fus1 KO小鼠和WT小鼠的P、E2、AMH水平,发现8周龄和12周龄的Fus1 KO小鼠的P、E2、AMH值均显著低于WT小鼠组（P＜0.05）;而20周龄、68周龄、74周龄的Fus1 KO小鼠的P、E2、AMH值和WT小鼠相比,没有显著统计学差异（P＞0.05）;1.3 8周龄,12周龄的Fus1 KO小鼠的初级卵泡和次级卵泡数均低于WT小鼠组（P＜0.05）,20周龄的Fus1 KO小鼠的次级卵泡数高于WT小鼠组（P＜0.05）;20周龄的Fus1 KO小鼠的初级卵泡数与WT小鼠组相比,没有显著统计学差异（P＞0.05）;68周龄,74周龄的Fus1 KO小鼠的初级卵泡和次级卵泡数和WT小鼠组相比,没有显著统计学差异（P＞0.05）;2.病毒融合纺锤体移植对重构胚发育,纺锤体组装,染色体的排列与分布影响2.1对照组和病毒融合后重构卵组之间的受精率、卵裂率、孵化率分别进行比较,没有显著统计学差异（P＞0.05）;对照组的囊胚率显著高于病毒融合后重构卵组（P＜0.05）;2.2将病毒融合纺锤体移植取核前组,取核后组和融合后组之间的Bub R1定位正常率、纺锤体形态正常率、染色体未分离率分别进行比较,发现均没有显著统计学差异（P＞0.05）;2.3将对照组和病毒融合后重构卵组的第五天囊胚核型异常率相比,没有显著统计学差异（P＞0.05）。结论:1.对线粒体遗传病鼠模型Fus1 KO小鼠卵巢功能进行研究,并发现其生殖繁育期卵巢储备功能明显减退,初步推测线粒体功能与卵巢储备功能直接相关;2.纺锤体移植技术病毒融合法不会对纺锤体的组装,染色体的排列与分布产生显著影响。