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目的:本研究以体外培养的人肾小球内皮细胞（human renal glomerular endothelial cells,HRGECs）及人肾小球足细胞（human glomerular podocytes,HPCs）为研究对象,探讨糖尿病肾病时HRGECs外泌体源性mi R-486-5p对HPCs损伤的影响及可能机制,为进一步探索糖尿病肾病（diabetic kidney disease,DKD）蛋白尿形成机制,寻求可能治疗靶点提供实验依据。方法:1.检测DKD肾小球内皮细胞来源的外泌体是否介导足细胞损伤以体外培养的HRGECs及HPCs为研究对象,将HRGECs随机分为对照组（control,葡萄糖浓度为5 m M）、高糖刺激组（high glucose,HG,葡萄糖浓度为30 m M）、甘露醇组（mannitol,MA,甘露醇浓度为30 m M）和TGF-β1刺激组（transforming growth factor-β1,TGF-β1,TGF-β1浓度为20 ng/ml）,培养48 h,更换为正常HRGECs的ECM培养基继续培养24 h:（1）取此培养上清与HPCs的培养基RPMI1640按照1:1的比例配制成条件培养基,以此条件培养基培养HPCs 48 h;（2）收集上清并提取外泌体,透射电镜及蛋白质免疫印迹（western blot,WB）鉴定外泌体形态和检测特异性标记蛋白的表达,免疫荧光（immunofluorescence,IF）验证PKH67标记的外泌体是否可被HPCs摄取;（3）提取外泌体,以30μg/ml浓度的外泌体刺激HPCs 48 h,收集各组HPCs,WB检测HPCs中nephrin和podocin蛋白表达水平。2.检测DKD肾小球内皮细胞来源的外泌体中mi R-486-5p是否参与介导足细胞损伤⑴以体外培养的HRGECs为研究对象,随机分为对照组、HG刺激组、MA组和TGF-β1刺激组,培养48 h,更换为正常HRGECs培养基ECM继续培养24 h,收集上清并提取外泌体,基因芯片技术筛选外泌体中差异表达的mi RNA,实时荧光定量PCR（quantitative real time polymerase chain reaction,real time PCR）检测各组外泌体中mi R-486-5p水平。⑵HRGECs随机分为对照组、HG组、MA组、HG+mi R-486-5p inhibitor组、HG+NC组以及TGF-β1组、TGF-β1+mi R-486-5p inhibitor组、TGF-β1+NC组,细胞融合至50%时进行转染,24 h后加入HG及TGF-β1刺激48 h,再更换为正常HRGECs培养基ECM继续培养24 h,收集培养上清,提取外泌体,real time PCR检测外泌体中mi R-486-5p水平;以30μg/ml浓度的外泌体刺激HPCs 48 h,real time PCR检测HPCs中mi R-486-5p水平,WB检测HPCs中nephrin、podocin蛋白表达水平。3.检测DKD肾小球内皮细胞来源的外泌体中mi R-486-5p是否通过调控PTEN/Akt信号通路,介导足细胞损伤HRGECs随机分为control、HG、MA、HG+mi R-486-5p inhibitor、HG+NC、TGF-β1、TGF-β1+mi R-486-5p inhibitor及TGF-β1+NC组,细胞融合至50%时进行转染,孵育24 h后加入高糖及TGF-β1刺激48 h,再更换为正常HRGECs培养基ECM继续培养24 h,收集培养上清,提取外泌体,以30μg/ml浓度的外泌体刺激HPCs 48 h,WB检测HPCs中PTEN（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten）、p-Akt、Akt蛋白表达水平。结果:1.DKD时肾小球内皮细胞来源的外泌体可介导足细胞的损伤⑴WB结果显示,与对照组相比,高糖及TGF-β1刺激HRGECs后,其培养上清会造成HPCs中nephrin和podocin蛋白水平降低。⑵透射电镜结果显示,HRGECs上清提取物为圆形或椭圆形,具有双层膜结构,直径为80-150 nm,符合外泌体形态特征;WB结果证实外泌体提取成功。IF结果显示,高糖及TGF-β1刺激HRGECs所分泌的外泌体可被HPCs摄取;且高糖及TGF-β1刺激HRGECs所分泌的外泌体可引起HPCs中nephrin和podocin蛋白水平降低。2.DKD时肾小球内皮细胞来源的外泌体中mi R-486-5p水平升高,进而引起足细胞损伤⑴提取外泌体,基因芯片技术筛选差异表达的mi RNA,显示mi R-486-5p水平升高。Real time PCR验证高糖及TGF-β1刺激HRGECs所分泌的外泌体mi R-486-5p水平升高,并且以此外泌体刺激HPCs,与对照组相比,足细胞中mi R-486-5p水平明显升高。⑵Real time PCR结果显示,在HRGECs中敲低mi R-486-5p后给予高糖或TGF-β1刺激,其所分泌的外泌体中mi R-486-5p水平下降,以此外泌体刺激HPCs,与HG+NC-exo组或TGF-β1+NC-exo组相比,HG+mi R-486-5p inhibitor-exo和TGF-β1+mi R-486-5p inhibitor-exo组足细胞中mi R-486-5p水平有所下降,nephrin和podocin蛋白升高。3.肾小球内皮细胞来源性外泌体中的mi R-486-5p通过调控PTEN/Akt信号通路,介导DKD时足细胞损伤WB结果显示,高糖及TGF-β1刺激HRGECs所分泌的外泌体会引起HPCs中PTEN蛋白表达水平降低,p-Akt-Ser473蛋白表达明显增加,而敲低HRGECs中的mi R-486-5p后,外泌体可引起HPCs中PTEN表达上调,p-Akt-Ser473水平下降。结论:在糖尿病肾病时,肾小球内皮细胞以外泌体形式分泌mi R-486-5p,通过激活PTEN/Akt信号通路介导足细胞损伤。