背景:呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus,RSV）是引起婴幼儿下呼吸道感染的重要病原,可引起间质性肺炎及毛细支气管炎。RSV不仅感染婴幼儿,免疫缺陷患者和老年人也是易感人群,目前临床上尚无安全有效的疫苗。上世纪60年代初研制的福尔马林灭活RSV疫苗（FI-RSV+铝佐剂）在婴幼儿中进行了临床试验,当RSV感染时,接种者不仅未被保护,反而引起了更严重的呼吸道炎症疾病,即疫苗增强性疾病,Th2型优势应答是该疾病的特征之一。卡介苗（Bacille CalmetteGuérin,BCG）是一种预防结核病的减毒活疫苗,可诱导强烈Th1型免疫应答,最近研究发现,BCG可以诱导固有免疫记忆（也叫训练免疫）,可以交叉保护儿童免受结核分枝杆菌以外的病原体侵害,目前,BCG已经作为多种疫苗的佐剂被研究。因此,我们推测:BCG作为FI-RSV+Al（OH）3疫苗的佐剂,可能通过抑制Th2优势应答、增强诱导免疫记忆的能力而提高该疫苗的安全性和保护性。目的:揭示卡介苗对FI-RSV疫苗增强性炎症疾病和保护性的调节作用及机制。方法:1.制备RSV病毒:培养Hep-2细胞,在Hep-2细胞上培养RSV,测定RSV滴度。2.制备疫苗:培养Vero细胞,在Vero细胞上培养RSV,制备福尔马林灭活疫苗（FI-RSV）和以氢氧化铝为佐剂的FI-RSV疫苗（FI-RSV+Al（OH）3）。3.动物实验:分别以新生小鼠和成年小鼠为动物模型进行研究3.1新生小鼠分组和免疫取BALB/c孕鼠,待孕鼠生产新生小鼠24h内（记为0天）,进行免疫,随机分为7组,分别为:（1）PBS组,（2）PBS/RSV组,（3）FI-RSV+Al（OH）3组,（4）BCG/FI-RSV+Al（OH）3组、（5）BCG/FI-RSV组,（4）（5）组0天皮下接种BCG;（1）-（5）第1天和第8天肌肉注射PBS、FI-RSV或FI-RSV+Al（OH）3;（6）BCG-2/FI-RSV+Al（OH）3组,0天皮下接种BCG,第14天半量BCG与FI-RSV+Al（OH）3混合,皮下注射疫苗,第21天皮下注射FI-RSV+Al（OH）3;（7）BCG-2/FI-RSV组,0天、7天皮下接种BCG,在第1天和第8天肌肉注射FI-RSV。3.2末次免疫14天后,用30μl TCID50=105.2/0.1ml的RSV滴鼻攻击被免疫的新生小鼠,攻毒后5天,检测BCG对新生小鼠安全性和保护性的影响。3.2.1检测疫苗的安全性3.2.1.1取肺泡灌洗液（BALF）,用光学显微镜进行白细胞计数3.2.1.2取肺组织做病理切片,进行H＆E染色,观察肺组织炎症情况3.2.1.3取肺组织,实时荧光定量PCR检测肺组织中细胞因子和转录因子,IFN-γ、T-bet、IL-5、IL-10、IL-13、GATA3、IL-17、IL-23、ROR-γt、eotaxin-1、Gro-α、MCP-1、IL-6、TNF-α基因的表达水平3.2.1.4检测气道高反应性3.2.2检测疫苗的保护性3.2.2.1实时定量PCR测定肺组织中RSV-N基因3.2.2.2滴定肺匀浆上清病毒滴度（TCID50）取肺组织,用匀浆管在冰上将肺组织研磨,离心取上清进行病毒滴度的检测。3.3疫苗诱导脾记忆细胞末次免疫2周后摘眼球取血处死新生小鼠,取样检测脾免疫记忆细胞。3.3.1流式细胞术检测脾表面标志CD3、CD62L、CD8、CD44,分析中央记忆性T细胞（Central Memory T cell,TCM）、效应记忆性T细胞（Effector Memory T cell,TEM）。3.3.2 ELISPOT检测脾脏分泌IL-4、IL-17和IFN-γ的记忆T淋巴细胞的数量3.3.3检测脾脏CTL杀伤活性3.4疫苗诱导肺记忆细胞3.4.1使用体内抗体标记方法来区分循环和肺组织中的细胞3.4.2流式细胞术检测肺组织表面标志CD3、CD69、CD8、CD103分析定居记忆T细胞（tissue-resident memory T cells,TRM）3.4.3检测肺组织CTL杀伤活性3.5流式细胞术检测肺组织记忆性（或训练）巨噬细胞3.5.1流式细胞检测肺组织表面标志CD49a、F4/80、MHCII,分析巨噬细胞及其活性3.5.2 F4/80+巨噬细胞经体外LPS刺激,流式检测表面活性分子的表达3.6过继转移肺组织CD3+T细胞、肺组织F4/80+巨噬细胞和脾脏CD3+T细胞,研究免疫记忆细胞的作用4.以成年鼠为动物模型进行研究4.1成年鼠分组和免疫4.1.1成年鼠组:领30只6周雌性BALB/c小鼠,分为（1）PBS组、（2）PBS/RSV组、（3）FI-RSV+Al（OH）3组、（4）BCG/FI-RSV组、（5）BCG/FI-RSV+Al（OH）3组。将接种BCG记为0天,（4）（5）组需要接种BCG组,0天皮下接种BCG,（1）-（5）组第1天、第11天、第21天肌肉注射PBS、FI-RSV或FI-RSV+Al（OH）3。4.1.2末次免疫2周后,用50μl TCID50=105.2/0.1ml的RSV滴鼻攻击被免疫成年鼠,攻毒后5天,检测疫苗佐剂对成年鼠的安全性和保护性的影响。4.2检测疫苗的安全性4.2.1取肺组织做病理切片,通过H＆E染色,观察肺组织炎症情况4.2.2取肺组织,实时荧光定量PCR检测肺组织中Th1、Th2、Th17型细胞因子IFN-γ、IL-5、IL-13、IL-17、IL-23、eotaxin-1、Gro-α、MCP-1基因的表达水平4.3检测疫苗的保护性4.3.1实时荧光定量PCR测定肺组织中RSV-N基因4.3.2 ELISA检测各组血清抗体Ig G末次免疫13天,成年鼠眼内眦取血,分离血清,用ELISA检测各组血清抗体Ig G水平。结果:1.成功获得TCID50=105.2/0.1ml滴度的RSV2.成功制备福尔马林灭活疫苗（FI-RSV）和以Al（OH）3为佐剂的福尔马林灭活疫苗FI-RSV+Al（OH）33.新生小鼠实验结果3.1新生小鼠接种BCG后的安全性影响3.1.1 BALF中炎症细胞计数结果显示:FI-RSV+Al（OH）3组细胞总数较各个组升高（P＜0.05）,BCG/FI-RSV+Al（OH）3组炎症细胞总数明显低于FI-RSV+Al（OH）3、BCG/FI-RSV和BCG-2/FI-RSV组（P＜0.05）,与PBS、PBS/RSV和BCG-2/FI-RSV+Al（OH）3组无统计学差异（P＞0.05）。3.1.2新生小鼠肺组织病理变化新生小鼠肺组织H＆E染色可见:PBS组,肺泡和支气管结构正常,未见炎症细胞浸润;PBS/RSV组,支气管局部有炎症细胞浸润,少量肺泡融合;FI-RSV+Al（OH）3组,支气管周围有明显炎症细胞浸润,肺泡壁增厚,肺泡融合,支气管柱状细胞向内突出;BCG/FI-RSV+Al（OH）3组,支气管周围炎症细胞浸润明显减轻,肺泡、支气管结构正常;BCG-2/FI-RSV+Al（OH）3组有明显的炎症细胞浸润,偶有肺泡融合;BCG/FI-RSV组,支气管局部有部分炎症细胞浸润,少量肺泡融合;BCG-2/FI-RSV组,炎症细胞浸润较FI-RSV+Al（OH）3减轻,支气管周围存在炎症细胞浸润,有明显的充血水肿,少量肺泡融合。病理评分结果显示:FI-RSV+Al（OH）3组评分高于其它各组（P＜0.05）;而BCG/FI-RSV+Al（OH）3组评分低于其它组（P＜0.05）,且与正常组无统计学差异（P＞0.05）,其它各疫苗组的评分均低于FI-RSV+Al（OH）3组,但均高于PBS组（P＜0.05）。3.1.3 BCG对新生小鼠肺组织细胞因子和转录因子表达的影响3.1.3.1肺组织中细胞因子:FI-RSV+Al（OH）3组eotaxin-1、Gro-α、MCP-1、IL-6、TNF-α表达水平较各组升高（P＜0.05）;BCG/FI-RSV+Al（OH）3、BCG/FI-RSV组各个细胞因子表达水平降低,并与正常组无统计学差异（P＞0.05）,但BCG/FI-RSV组MCP-1表达水平较BCG/FI-RSV+Al（OH）3升高（P＜0.05）;BCG-2/FI-RSV组小鼠的细胞因子表达水平也较低,但与BCG/FI-RSV+Al（OH）3或BCG/FI-RSV组小鼠相比,eotaxin-1的表达水平较高（P＜0.05）;BCG-2/FI-RSV+Al（OH）3组IL-6、TNF-α表达水平与FI-RSV+Al（OH）3组无统计学差异（P＞0.05）,其他因子与FI-RSV+Al（OH）3组相比降低（P＜0.05）;结果表明:BCG/FI-RSV+Al（OH）3组和BCG/FI-RSV组细胞因子表达水平降低,其中BCG/FI-RSV+Al（OH）3组细胞因子表达水平最低。3.1.3.2 Th1/2/17型细胞因子和转录因子的表达FI-RSV+Al（OH）3组IFN-γ、IL-5、IL-10、IL-13、IL-17、IL-23表达水平较各组升高（P＜0.05）;BCG/FI-RSV+Al（OH）3组IFN-γ表达水平与BCG-2/FI-RSV+Al（OH）3组、BCG-2/FI-RSV组相比升高（P＜0.05）;BCG/FI-RSV+Al（OH）3组IL-5、IL-10、IL-13、IL-17、IL-23表达水平较FI-RSV+Al（OH）3组明显降低（P＜0.05）,且与正常组相比无统计学差异（P＞0.05）;BCG-2/FI-RSV+Al（OH）3组IL-5、IL-10、IL-13、IL-23表达水平升高与FI-RSV+Al（OH）3组相比无统计学差异（P＞0.05）,BCG/FI-RSV组IL-10、IL-13、IL-17、IL-23表达水平较FI-RSV+Al（OH）3组明显降低（P＜0.05）,但对肺中IL-5无抑制作用（P＞0.05）,IL-17表达水平较BCG/FI-RSV+Al（OH）3组升高（P＜0.05）;BCG-2/FI-RSV组IL-17表达水平升高,与BCG/FI-RSV+Al（OH）3组有统计学差异（P＜0.05）。根据病理切片和细胞因子结果表明:BCG作为佐剂免疫后预防了肺部炎症,明显的抑制了FI-RSV+Al（OH）3引起的Th2和Th17型应答,下一步重点检测BCG/FI-RSV+Al（OH）3组和BCG/FI-RSV组的转录因子。之后进一步检测Th1型、Th2型、Th17型转录因子,BCG/FI-RSV+Al（OH）3组、BCG/FI-RSV组T-bet的表达水平较FI-RSV+Al（OH）3组、PBS组明显升高（P＜0.05）;PBS组、BCG/FI-RSV+Al（OH）3组GATA3、ROR-γt表达水平与FI-RSV+Al（OH）3组、BCG/FI-RSV组相比明显降低（P＜0.05）。这些结果表明:FI-RSV+Al（OH）3组在RSV攻击后肺部免疫应答类型为Th2和Th17型优势应答,而BCG/FI-RSV+Al（OH）3组Th2和Th17型应答明显降低,免疫应答更平衡,在后续的实验中重点研究BCG/FI-RSV+Al（OH）3组,后面的三组不再进行研究。3.1.4新生小鼠接种BCG后气道高反应性的变化当Mch浓度为50mg/ml时,FI-RSV+Al（OH）3组气道阻力（RI）较PBS组显著升高（P＜0.05）,而BCG/FI-RSV+Al（OH）3组较FI-RSV+Al（OH）3组明显减低（P＜0.05）,且与PBS组无统计学差异。以上所有结果表明:BCG作为疫苗FI-RSV+Al（OH）3的佐剂,抑制了疫苗增强性疾病,提高了疫苗的安全性。3.2新生小鼠接种BCG后产生的保护性作用3.2.1.通过检测肺组织中RSV-N基因测定肺组织病毒载量PBS/RSV组RSV-N表达水平作为对照（即100%）,与FI-RSV+Al（OH）3组、BCG/FI-RSV组、BCG-2/FI-RSV组与之相比无统计学差异（P＞0.05）;BCG/FI-RSV+Al（OH）3组和BCG-2/FI-RSV+Al（OH）3组RSV-N表达水平较PBS/RSV组和FI-RSV+Al（OH）3组降低（P＜0.05）。3.2.2滴定肺匀浆上清病毒滴度（TCID50）BCG/FI-RSV+Al（OH）3组肺匀浆上清病毒滴度与PBS/RSV组相比显著降低（P＜0.05）,其他各组间无统计学差异（P＞0.05）。结果表明:与FI-RSV+Al（OH）3相比,BCG/FI-RSV+Al（OH）3免疫新生小鼠降低了RSV复制,提高了保护性。3.3 BCG诱导的脾记忆细胞产生3.3.1脾组织TCM、TEM结果分析BCG/FI-RSV+Al（OH）3组的CD3+及CD3+CD8+T细胞比例均高于PBS及FI-RSV+Al（OH）3组（P＜0.05）;FI-RSV+Al（OH）3显著抑制了CD3+及CD3+CD8-（即CD4+）T细胞;FI-RSV+Al（OH）3、BCG/FI-RSV+Al（OH）3组中以CD3+T细胞为门或以CD3+CD8+T细胞为门CD62L+CD44+TCM细胞比例较PBS组明显升高（P＜0.05）;但BCG/FI-RSV+Al（OH）3组中以CD3+CD8-（即CD4+）T细胞的CD62L+CD44+TCM细胞显著高于FI-RSV+Al（OH）3和PBS组（P＜0.05）;BCG/FI-RSV+Al（OH）3组的CD3+以及CD3+CD8-（即CD4+）的CD62L-CD44+TEM亦显著高于FI-RSV+Al（OH）3组（P＜0.05）。结果显示:出生时卡介苗增强了FI-RSV+Al（OH）3诱导CD8-（即CD4+）TCM和TEM的能力。3.3.2 BCG刺激脾脏中Th1型记忆T淋巴细胞的数量的产生FI-RSV+Al（OH）3组的分泌IL-17、IL-4和IFN-γ的记忆T淋巴细胞的数量均显著高于PBS组,而BCG/FI-RSV+Al（OH）3组分泌IL-17和IL-4的细胞数量与FI-RSV+Al（OH）3组相比明显降低（P＜0.05）;FI-RSV+Al（OH）3组和BCG/FI-RSV+Al（OH）3组分泌IFN-γ的细胞数量无显著差异（P＞0.05）。结果显示:BCG作为佐剂可抑制FI-RSV+Al（OH）3诱导的Th2和Th17记忆细胞。3.3.3 BCG对新生小鼠脾细胞特异性CTL杀伤活性的影响当效靶比为12.5:1、25:1、50:1和100:1时,BCG/FI-RSV+Al（OH）3组较PBS组、FI-RSV+Al（OH）3组相比CTL杀伤活性明显升高（P＜0.05）,表明:BCG促进了FI-RSV+Al（OH）3诱导CTL免疫记忆。3.4疫苗诱导的肺记忆细胞产生3.4.1肺组织定居记忆细胞结果表明:肺组织单细胞FITC-CD3+T细胞含量极少,多数为APC-CD3标记的T细胞,循环T细胞未进入肺组织中,肺组织检测到的T细胞是组织定居T细胞。3.4.2 TRM结果分析BCG/FI-RSV+Al（OH）3组肺组织CD3+CD69+CD103+细胞比例、CD3+CD8+CD69+CD103+细胞比例、CD3+CD8-CD69+CD103+细胞比例与PBS组和FI-RSV+Al（OH）3组相比明显升高（P＜0.05）;结果表明:BCG促进FI-RSV+Al（OH）3诱导肺TRM。3.4.3 BCG对新生小鼠肺细胞特异性CTL杀伤活性的影响当效靶比为12.5:1、25:1、50:1和100:1时,BCG/FI-RSV+Al（OH）3组较PBS组、FI-RSV+Al（OH）3组相比CTL杀伤活性升高（P＜0.05）。3.5接种BCG后对新生小鼠肺部巨噬细胞的影响3.5.1检测肺组织定居细胞检测BCG/FI-RSV+Al（OH）3组小鼠肺组织CD49a的表达情况,结果表明:新生小鼠肺组织大部分都是定居细胞。3.5.2 BCG/FI-RSV+Al（OH）3组的F4/80+巨噬细胞比例较PBS组、FI-RSV+Al（OH）3组升高,但无统计学差异（P＞0.05）;FI-RSV+Al（OH）3、BCG/FI-RSV+Al（OH）3组的MHCII-F4/80+细胞比例较PBS组升高（P＜0.05）,PBS组的MHCIIlowF4/80+细胞比例较FI-RSV+Al（OH）3组升高（P＜0.05）,其他各组间无统计学差异（P＞0.05）;FI-RSV+Al（OH）3组、BCG/FI-RSV+Al（OH）3组的MHCIIintF4/80+细胞比例较PBS组升高（P＜0.05）,BCG/FI-RSV+Al（OH）3组的MHCIIhigF4/80+细胞比例较PBS组、FI-RSV+Al（OH）3组升高（P＜0.05）,且FI-RSV+Al（OH）3组的MHCIIhigF4/80+细胞比例较PBS组升高（P＜0.05）。结果提示:BCG促进FI-RSV+Al（OH）3诱导记忆相巨噬细胞,且主要促进MHCII高表达的巨噬细胞。3.5.3分选F4/80+巨噬细胞,经体外LPS刺激,流式检测表面活性分子的表达FI-RSV+Al（OH）3组抑制了MHCII分子的表达,接种BCG后恢复了MHCII分子的表达。3.6将BCG/FI-RSV+Al（OH）3组的肺CD3+T细胞（Transfer lung T cells）、肺F4/80+细胞（Transfer lung macrophages）和脾CD3+T细胞（Transfer spleen T cells）分别过继转移给FI-RSV+Al（OH）3组,24h后攻毒,5天后检测结果。3.6.1安全性检测3.6.1.1肺泡灌洗液（BALF）中白细胞总数过继肺组织F4/80+细胞白细胞总数明显降低（P＜0.05）,其他各组无统计学意义。3.6.1.2肺组织病理变化FI-RSV+Al（OH）3组:支气管周围有明显的炎症细胞浸润,肺泡壁增厚,肺泡融合,支气管柱状细胞向内突出;过继肺组织CD3+T细胞组、过继肺组织F4/80+细胞组和过继脾脏CD3+T细胞组经RSV攻毒后,炎症明显减轻,但支气管周围都有少量炎症细胞浸润,肺泡结构相对完整。根据病理切片评分,FI-RSV+Al（OH）3组炎症最重,与各个组都有统计学差异（P＜0.05）;过继脾脏CD3+T细胞组与过继肺组织CD3+T细胞、过继肺组织F4/80+细胞组相比炎症较重（P＜0.05）。3.6.1.3 FI-RSV+Al（OH）3组小鼠尾静脉过继分选细胞后对小鼠肺组织细胞因子的影响过继肺组织CD3+T细胞、过继肺组织F4/80+细胞组和过继脾脏CD3+T细胞组的eotaxin-1、Gro-α、IL-17的表达水平较FI-RSV+Al（OH）3组明显降低（P＜0.05）;过继肺组织CD3+T细胞、过继肺组织F4/80+细胞组IL-5的表达水平较FI-RSV+Al（OH）3组明显降低（P＜0.05）,过继脾脏CD3+T细胞组IFN-γ的表达水平较FI-RSV+Al（OH）3组明显降低（P＜0.05）,结果提示:过继肺记忆T细胞或巨噬细胞明显抑制炎症因子和Th2/Th17型细胞因子,而过继脾脏记忆T细胞抑制炎症因子和Th1/Th17型细胞因子。3.6.1.4气道高反应性当Mch浓度为50mg/ml时,过继肺组织F4/80+细胞组、过继肺组织CD3+T细胞组与FI-RSV+Al（OH）3、过继脾脏CD3+T细胞组的气道阻力（RI）相比明显降低（P＜0.05）,其他各组无统计学意义。3.6.2疫苗保护性3.6.2.1实时定量PCR测定肺组织中RSV-N基因表达水平结果显示:RSV-N:过继肺组织CD3+T细胞、过继肺组织F4/80+细胞组RSV-N未检测出,过继脾脏CD3+T细胞组RSV-N表达水平明显低于未过继组（P＜0.05）,表明:过继BCG/FI-RSV+Al（OH）3组的免疫记忆细胞可明显提高FI-RSV+Al（OH）3的保护能力。以上结果提示:BCG/FI-RSV+Al（OH）3诱导的肺TRM和巨噬细胞在抑制疫苗增强性疾病中发挥关键作用。4.成年鼠实验结果4.1检测疫苗的安全性4.1.1成年鼠肺组织病理变化成年鼠肺H＆E染色可见:PBS组:肺泡和支气管结构正常,未见炎症细胞浸润;PBS/RSV组:支气管局部有炎性细胞浸润,部分肺泡发生融合;FI-RSV+Al（OH）3组:支气管周围有明显的炎症细胞浸润,肺泡壁增厚,肺泡融合,支气管柱状细胞向内突出;BCG/FI-RSV组:炎症细胞浸润明显减轻,肺泡壁趋于正常,偶有肺泡存在融合;BCG/FI-RSV+Al（OH）3:有明显的炎症细胞浸润,肺泡壁增厚,肺泡融合,支气管周围存在炎症细胞浸润,但较FI-RSV+Al（OH）3组炎症减轻,与BCG/FI-RSV组相比,炎症症状较重。根据病理切片评分,FI-RSV+Al（OH）3组炎症最重,与各个组都有统计学差异（P＜0.05）;BCG/FI-RSV组炎症最轻,除正常组外与其他组都有统计学差异（P＜0.05）。4.1.2接种BCG对成年小鼠肺组织细胞因子表达的影响4.1.2.1肺组织内细胞因子m RNA的表达水平FI-RSV+Al（OH）3组eotaxin-1、Gro-α、MCP-1的表达水平与各组相比明显升高（P＜0.05）;BCG/FI-RSV组、BCG/FI-RSV+Al（OH）3组eotaxin-1、Gro-α、MCP-1的表达水平与FI-RSV+Al（OH）3组相比降低且与正常组无统计学差异（P＞0.05）。4.1.2.2 Th1/2/17型细胞因子的表达BCG/FI-RSV组和BCG/FI-RSV+Al（OH）3组IFN-γ的表达水平较FI-RSV+Al（OH）3组升高（P＜0.05）;FI-RSV+Al（OH）3组IL-5、IL-13、IL-17、IL-23的表达水平升高（P＜0.05）;BCG/FI-RSV组IL-5、IL-13、IL-17、IL-23的表达水平与FI-RSV+Al（OH）3组相比降低（P＜0.05）且与正常组无统计学差异（P＞0.05）;而BCG/FI-RSV+Al（OH）3组IL-17表达水平与FI-RSV+Al（OH）3组相比无统计学差异（P＞0.05）。结果显示:对于成年鼠免疫组BCG/FI-RSV组Th1型因子明显升高、抑制Th2/Th17型应答。4.2疫苗的保护性4.2.1肺组织内RSV基因RSV-N的表达PBS组、FI-RSV+Al（OH）3组、BCG/FI-RSV组和BCG/FI-RSV+Al（OH）3组RSV-N的表达水平较PBS/RSV组明显降低（P＜0.05）,其他各组RSV-N的表达水平无统计学差异（P＞0.05）。4.2.2成年鼠接种BCG后血清中特异性抗体Ig G水平变化PBS组未检测到Ig G产生,各疫苗免疫组的Ig G水平显著高于PBS组（P＜0.05）,其它各组均无统计学差异（P＞0.05）。结论:1.BCG作为疫苗FI-RSV+Al（OH）3的佐剂,提高了疫苗的安全性和保护性。2.BCG作为疫苗FI-RSV+Al（OH）3的佐剂,增强了疫苗诱导脾记忆性T细胞、肺组织定居记忆T细胞和训练巨噬细胞的能力,调节了Th记忆应答的平衡。3.肺定居记忆T细胞和巨噬细胞在抑制疫苗增强性疾病中发挥着关键作用。