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目的:狼疮性肾炎（lupus nephritis,LN）是系统性红斑狼疮最常见也是最严重的并发症之一,足细胞结构或功能异常在LN发病尤其是蛋白尿的形成中起重要作用。近来研究发现泛素-蛋白酶体通路中无论是泛素化酶还是去泛素化酶均参与系统性红斑狼疮及狼疮性肾炎的发生发展。本课题组前期研究发现去泛素化酶-泛素特异性蛋白酶46（ubiquitin specific pro tease,USP46）m RNA在LN患者外周血中的表达水平显著高于健康对照人群。预实验结果显示,USP46在LN患者肾脏中主要定位于足细胞,且与足细胞标志蛋白podocin表达呈负相关,因此我们推测USP46可能与足细胞损伤有关,然而其具体机制尚不完全清楚。本研究以LN患者肾穿活检组织、MRL/lpr狼疮模型小鼠和体外培养人足细胞（human podocytes,HPCs）为研究对象,探讨去泛素化酶USP46在LN肾小球足细胞损伤中的作用及可能机制,为进一步揭示LN的发病机制,探索新的药物靶点提供实验依据。方法:1.以LN患者肾穿活检组织作为狼疮性肾炎（LN）组,因手术切除并经病理诊断为正常的肾组织作为对照（Control）组,共收集LN组20例,Control组10例。HE和PAS染色观察肾组织形态学改变;免疫组织荧光技术（immunofluorescence,IF）检测USP46、nestin在肾小球中的定位;免疫组织化学技术（immunohistochemistry,IHC）检测肾小球中USP46、podocin的表达情况,分析USP46与足细胞损伤之间的关系。2.30周龄雌性MRL/lpr小鼠7只,作为狼疮性肾炎模型组,同周龄雌性MRL/Mp J小鼠7只作为对照组,分别收集血液、尿液标本后处死小鼠,留取双侧肾组织。CBB法检测小鼠尿蛋白水平,肌氨酸氧化酶法检测小鼠血肌酐水平,HE和PAS染色观察肾组织形态学改变;IHC检测肾小球中USP46、nephrin的表达。3.以人足细胞（HPCs）为研究对象,检测LN环境下,USP46蛋白的表达及其对足细胞损伤和线粒体功能障碍的影响（1）观察狼疮性肾炎患者置换血浆（LN plasma）对足细胞损伤及USP46蛋白表达水平的影响:5%LN plasma刺激HPCs 0 h、24 h、48 h,收集细胞,western blot方法检测足细胞标志蛋白podocin和nephrin及USP46蛋白的表达情况;细胞免疫荧光技术检测USP46的表达和定位。（2）观察LN plasma对足细胞线粒体功能障碍的影响:5%LN plasma刺激HPCs 0 h、24 h、48 h,收集细胞,细胞免疫荧光技术和western blot方法检测线粒体标志蛋白COXⅣ的表达情况;生物荧光技术检测细胞中ATP的生成情况;流式细胞术检测足细胞中ROS生成情况;JC-1染色后采用激光共聚焦显微镜观察足细胞线粒体膜电位变化。（3）过表达USP46蛋白或是采用小干扰RNA敲低USP46对LN plasma诱导的足细胞损伤及线粒体功能障碍的影响:将HPCs随机分为转染空载质粒组（Flag-Vec）和过表达USP46质粒组（Flag-USP46）,或是敲低对照组（si RNA-NC）和敲低USP46组（si RNA-USP46）,转染质粒或是si RNA24 h后,给予5%LN plasma刺激细胞48 h,收集细胞,western blot方法检测足细胞标志蛋白podocin、nephrin的表达及USP46、COXⅣ蛋白的表达;生物荧光技术检测细胞中ATP的生成情况;流式细胞术检测足细胞中ROS生成情况;JC-1染色后采用激光共聚焦显微镜观察足细胞线粒体膜电位变化。结果:1.USP46在LN肾小球足细胞中表达升高,且与蛋白尿形成密切相关（1）临床标本IF和IHC结果显示,USP46蛋白主要定位于肾小球足细胞胞浆中,且在LN组表达明显升高;而podocin蛋白在LN组表达明显降低。相关性分析结果显示,USP46与podocin蛋白表达呈显著负相关（r=-0.57,P＜0.01）;与患者24 h尿蛋白呈正相关（r=0.508,P＜0.05）。（2）动物实验与MRL/Mp J小鼠相比,MRL/lpr小鼠24 h尿蛋白和血肌酐明显增加;HE及PAS染色结果显示,MRL/lpr小鼠肾小球体积增大,细胞数目明显增多,系膜区明显增宽,基质沉积明显增多。IHC结果显示,USP46蛋白阳性信号主要位于小鼠肾小球足细胞的胞浆,且与对照小鼠相比,MRL/lpr小鼠USP46蛋白表达明显增高;而在MRL/lpr小鼠肾小球中nephrin阳性表达明显低于MRL/Mp J小鼠。相关性分析结果显示,在两组小鼠肾小球中USP46蛋白表达与nephrin蛋白表达呈负相关（r=-0.78,P＜0.01）;与小鼠24 h尿蛋白呈正相关（r=0.763,P＜0.01）。2.LN plasma对USP46蛋白表达及足细胞损伤的影响Western blot及IF结果显示:LN plasma刺激HPCs 48 h后,USP46蛋白表达明显增加,且定位于细胞线粒体;而podocin、nephrin蛋白表达明显降低。LN plasma诱导足细胞线粒体功能障碍:LN plasma刺激HPCs 48 h后,COXⅣ蛋白表达明显降低,线粒体ATP生成减少,ROS产生减少;同时JC-1染色共聚焦观察显示,LN plasma刺激HPCs 24 h、48 h时,红色荧光/绿色荧光比值明显降低。3.USP46参与狼疮性肾炎时足细胞损伤和线粒体功能障碍与Flag-Vec组相比,Flag-USP46组足细胞标志蛋白podocin的表达明显降低,足细胞损伤加重;同时Flag-USP46组COXⅣ蛋白表达明显降低,线粒体生成减少,ATP的生成减少,ROS的生成减少,线粒体红色荧光/绿色荧光比值降低。与si RNA-NC组相比,si RNA-USP46组足细胞标志蛋白podocin的表达明显增加,足细胞损伤减轻;si RNA-USP46组COXⅣ蛋白表达明显增加,线粒体生成增加,ATP的生成增加,ROS的生成增加,线粒体红色荧光/绿色荧光比值增加。结论:在狼疮性肾炎时USP46可能通过影响足细胞裂孔膜蛋白的表达和线粒体的功能,介导了足细胞损伤与蛋白尿形成。