抗体是机体分泌的可与相应抗原特异性结合的免疫球蛋白,主要存在于机体的内环境中,具有保护机体健康的功能。在哺乳动物中,母源抗体通过母乳进入幼子肠道内,能够给予肠道被动免疫,使其免受病原微生物的感染。近些年来,越来越多的研究发现,在幼龄动物饲料中添加抗体可有效预防动物肠道疾病。因此,研制动物用口服抗体对保障动物健康具有重要意义。本研究构建了四种猪用口服抗体,选用毕赤酵母表达系统进行重组表达,探究重组抗体在毕赤酵母中的表达水平以及诱导条件对重组抗体表达量的影响,并鉴定重组抗体的活性,以期为猪用口服抗体的制备技术及功能研究提供参考,也为抗生素的替代提供新思路。在已报道的研究中,两种抗肠毒性大肠杆菌（ETEC）鞭毛黏附素Fae G蛋白抗体的重链可变区（VHH）片段VHH2、VHH3已被证明具有良好的生物学功能,本研究借鉴了以上VHH片段,将其分别融合至猪Ig A的可结晶片段（Fc）区域,构成V2A、V3A重组抗体;将VHH2、VHH3片段融合至猪Ig G的Fc区域两端,构成V23G双功能重组抗体;将VHH2、VHH3片段相连,构成V23双功能重组抗体。研究分为以下三个试验:试验一:将表达四种重组抗体的基因序列连入毕赤酵母表达载体pPICZαA,构建pPICZαA-V2A、pPICZαA-V3A、pPICZαA-V23G和pPICZαA-V23重组质粒,将以上重组质粒线性化后电转入野生型毕赤酵母X-33细胞。制得的重组酵母利用甲醇进行诱导表达,通过ELISA筛选阳性转化子,并将表达产物进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。最后,利用亲和层析柱纯化各重组抗体。结果表明,V2A、V3A、V23G、V23抗体在重组酵母中成功表达,利用Protein A亲和层析柱和His镍柱分别从pPICZαA-V23G-X33、pPICZαA-V23-X33重组酵母上清液中获得了高纯度的V23G、V23抗体,利用Protein A和Protein G亲和层析柱未能成功纯化V2A、V3A抗体。试验二:通过单因素试验和正交试验探究初始菌浓度、甲醇添加量、培养基p H和诱导时长四种诱导条件对四种重组抗体表达量的影响,结果表明四种重组抗体在毕赤酵母中表达的最适诱导条件均不相同。在设置区间内,V2A抗体在重组酵母中表达的最适诱导条件为初始菌浓度OD600nm=20、甲醇添加量1.0%、培养基p H=7.0、诱导时长120 h;V3A抗体在重组酵母中表达的最适诱导条件为初始菌浓度OD600nm=20、甲醇添加量1.5%、培养基p H=6.0、诱导时长为120 h;V23G抗体在重组酵母中表达的最适诱导条件为初始菌浓度OD600nm=15、甲醇添加量1.5%、培养基p H=7.0、诱导时长为120 h;V23抗体在重组酵母中表达的最适诱导条件为初始菌浓度OD600nm=20、甲醇添加量1.5%、培养基p H=6.0、诱导时长为72 h。试验依据ELISA实验原理构建了四种抗体的定量方法,以蛋白胶回收的V2A、V3A抗体和纯化获得的V23G、V23抗体分别作为定量标准品,采用双夹心ELISA测定V2A、V3A、V23G抗体的表达量,采用直接ELISA测定V23抗体的表达量。试验测得诱导条件优化后的V2A抗体表达量为342 mg/L、V3A抗体表达量为317mg/L、V23G抗体表达量为142 mg/L、V23抗体表达量为937 mg/L。试验三:通过全菌包被间接ELISA探究V2A、V3A、V23G、V23抗体的活性,结果表明,四种重组抗体与ETEC均具有结合活性。试验测定了四种抗体与ETEC结合的半数有效浓度(EC50),结果为V2A抗体与ETEC结合的EC50为9.88μg/m L、V3A抗体与ETEC结合的EC50为8.43μg/m L、V23G抗体与ETEC结合的EC50为9.48μg/m L、V23抗体与ETEC结合的EC50为1.12μg/m L。综上所述,本研究成功构建了四种猪用口服抗体的表达载体,并在毕赤酵母中成功表达,通过优化酵母诱导条件提高了重组抗体的表达量,并且四种重组抗体与ETEC均具有结合活性。