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乳腺炎是奶牛最为常见的疾病之一,给畜牧业造成了严重的经济损失。大肠杆菌是引起临床型乳腺炎的主要病原微生物。在经典的炎性通路中,TLR4（Toll-like receptor 4）识别大肠杆菌毒性因子LPS（lipopolysaccharide）,通过髓样分化因子88（My D88）激活MAPK（mitogen-activated protein kinase）和NF-κB（nuclear factor kappa B）等信号通路,促进炎性因子及其介导因子的表达,从而导致氧化应激与炎症的发生。奶牛乳腺炎的治疗世界各国普遍优先选用抗生素类药物。但是,抗生素的效果非常有限,同时抗生素的滥用引起细菌产生耐药性以及乳汁抗生素残留问题,严重威胁消费者的健康。植物活性成分毒性低、无残留、不易产生耐药性,在奶牛乳腺炎的防治中受到广泛的关注。表儿茶素是一种普遍存在于葡萄,蓝莓,可可,茶树等植物体内的天然多酚物质,是黄烷醇类化合物的单体之一,具有很强的抗癌、抗炎、抗氧化活性,但其在乳腺炎中的作用及其分子机制尚未报道。本研究以LPS诱导的体内和体外模型,ELISA方法检测了表儿茶素对炎性介导因子的抑制作用;免疫组化的方法检测了表儿茶素对BALB/c小鼠乳腺组织中T细胞浸润的影响;Western blot、ELISA和免疫荧光方法检测了表儿茶素对NF-κB及MAPK信号通路关键蛋白表达和磷酸化的影响;进一步利用RNA-seq、TMT联合LC-MS/MS技术分析表儿茶素对LPS刺激的MAC-T细胞中转录组和蛋白组的变化,免疫沉淀技术（Co IP）分析蛋白间的相互作用,揭示表儿茶素抗炎的关键上游靶基因及分子机制。结果如下:1.MTT试验表明,1.5、7.5、15、30 mg/m L表儿茶素处理对MAC-T细胞活性没有影响（P>0.05）。1μg/m L的LPS刺激24 h显著提高了MAC-T细胞IL-1β（interleukin-1）、IL-6（interleukin-6）、TNF-α（tumor necrosis factor-α）以及炎性介导因子COX-2（cyclooxygenase-2）和i NOS（inducible nitric oxide synthase）的水平（P<0.05）。2.利用ELISA检测了MAC-T细胞中炎性因子的表达。与LPS处理组相比,1.5、7.5、15、30 mg/m L的表儿茶素分别与LPS（1μg/m L）共处理24 h显著或极显著降低:（1）MAC-T细胞炎症因子IL-1β（P<0.01）、IL-6（P<0.01）、TNF-α（P<0.05）和炎性介导因子COX-2（P<0.05）和i NOS（P<0.01）的蛋白质水平;（2）NF-κB通路IκB和p65磷酸化水平（P<0.05）以及p65核转移免疫荧光信号（P<0.05）;（3）MAPK通路p38、ERK1/2和JNK1/2的磷酸化水平（P<0.05）。3.采用表儿茶素寡聚物原花青素（OPC）处理细胞,ELISA检测表明,1、3和5μg/m L的OPC显著降低了LPS诱导的炎性因子IL-1β（P<0.01）、IL-6（P<0.01）、TNF-α（P<0.05）和炎性介导因子COX-2（P<0.05）、i NOS（P<0.01）的蛋白水平。免疫荧光和Western blot结果显示,OPC能显著下调LPS诱导的p65的磷酸化和IκB的表达（P<0.01）,并抑制p65的核转移。此外,OPC显著降低了LPS诱导的ERK1/2、JNK1/2和p38的磷酸化水平（P<0.01）。4.为进一步验证体外研究结果,选择产仔7d的泌乳母鼠,向母鼠的第四对乳房中注射50μL浓度为0.2 mg/m L的LPS诱发乳腺炎症,腹腔注射10、20和30mg/kg的表儿茶素处理24 h。与LPS处理组相比,各浓度表儿茶素与LPS共处理显著降低:（1）小鼠乳腺组织T细胞分子标记物CD3水平（P<0.05）;（2）炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）和炎性介导因子（COX-2和i NOS）的表达量（P<0.05）;（3）NF-κB通路（IκB、p65）和MAPK通路（p38、ERK1/2、JNK1/2）磷酸化水平（P<0.05）与p65核转移免疫荧光信号（P<0.05）。5.为了筛选表儿茶素上游靶标,检测了LPS与表儿茶素共处理的MAC-T细胞转录组和蛋白组的变化。与LPS对照组相比,RNA-seq分析发现156个基因出现差异表达（FDR<0.05）,这些差异基因富集的KEGG通路包括cytokine-cytokine receptor interaction、MAPK signaling pathway、inflammatory mediator regulation of TRP channels等;富集的GO功能包括extracellular space、external side of plasma membrane、inflammatory response和Immune response等。TMT联合LC-MS/MS分析发现30个差异蛋白（FDR<0.05）,主要富集在Endoplasmic reticulum unfolded protein response、ER to Golgi transport vesicle membrane等GO功能。6.选择转录和蛋白质水平均上调且表达量变化较高的TMEM35A（transmembrane protein 35A）和TMPO（thymopoietin）基因,利用CRISPR/Cas9构建两基因的sg RNA表达载体。结果显示,分别敲除TMPO和TMEM35A后p65磷酸化水平以及TLR4、TNF-α和i NOS蛋白水平极显著上升（P<0.01）。7.为验证了TMEM35A是否通过TMPO调控NF-κB信号通路,设计了带有His标签的TMEM35A过表达载体p CMV-TMEM35A-His。仅转染Cas9-TMEM35A,MAC-T细胞TMPO蛋白水平显著降低（P<0.01）,但是在转染Cas9-TMEM35A的MAC-T细胞中再转染p CMV-TMEM35A-His,TMPO水平与对照组没有差异（P>0.05）,而且TLR4、p-p65、TNF-α和i NOS蛋白水平也极显著增加（P<0.01）。8.为考察TMEM35A是否与TMPO相互作用来阻断LPS刺激的炎症反应,在转染p CMV-TMEM35A-His的MAC-T细胞中,用LPS和表儿茶素处理24 h,Co IP技术证实两蛋白存在互作。综合上述结果,表儿茶素通过MAPK和NF-κB通路抑制MAC-T细胞和小鼠乳腺炎性反应;TMEM35A介导表儿茶素的跨膜转运,并且通过与TMPO互作抑制NF-κB信号通路。本研究结果为全面揭示表儿茶素的抗炎机制以及在奶牛乳腺炎防治中的应用提供了新的数据。