一个甘蓝型油菜超长角果突变体雌蕊发育分子机理的研究

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甘蓝型油菜(Brassica napus L.,简称油菜)是我国重要的油料作物和经济作物。对于油菜以及许多农作物,花器官的发育是关系到其产量和经济价值的重要事件,其中雌性生殖器官——雌蕊,最终能够发育成果实,对包括油菜在内的许多作物的种子产量和质量具有直接的、决定性的影响。关于雌蕊发育机制的研究主要依赖于拟南芥突变体,然而到目前为止,这些突变体均为缺陷型或雌性不育突变体。本研究前期工作获得一个具有超长角果表型的甘蓝型油菜T-DNA插入突变体Bnspt(B.napus super pistil mutant),本研究对此进行雌蕊发育的相关研究,其主要结果如下:(1)首先Bnspt突变体进行表型的调查分析。结果显示,与未转化油菜植株(CK,对照)相比,展现出超长角果的表型的Bnspt突变体,种子体积增大,千粒重为6.61g,约为CK的2倍多。而每角果粒数、每分枝角果数、一次有效分枝数以及株高等表型没有显著性改变。(2)进而,使用RNA-Seq方法去分析Bnspt与CK之间的差异表达基因。按照FDR<0.05,|FC|≥2标准,发现有9,022个基因的表达发生显著改变,其中上调基因有4,795个,下调基因有4,227个。GO富集结果显示,差异基因富集数目最多的是“Cellular Component”大类,包含7,592个差异基因;KEGG通路富集分析发现,差异表达基因主要集中于蛋白质在内质网中的加工,亚油酸代谢以及戊糖和葡萄糖醛酸相互转化等生物学通路中,其中富集的差异基因最多的是蛋白质在内质网中的加工。(3)我们进一步对相关于激素信号途径的差异表达基因进行分析。结果显示,生长素、细胞分裂素、赤霉素和油菜素内酯等信号途径均存在差异表达基因,建议这些信号途径均在Bnspt的雌蕊发育中起作用。(4)使用FPNI-PCR(Fusion primer and nested integrated PCR)方法进行Bnspt突变体基因组T-DNA插入的侧翼序列的扩增,并克隆了被插入的基因,命名为Bn SPT。序列分析显示,Bn SPT编码一个由302个氨基酸组成的蛋白质;组织模式表达分析显示,Bn SPT在角果和花中表达极为显著,表达量分别达到茎中表达量的71.92倍和11.01倍,这建议Bn SPT在角果和花的发育中起作用。此外,我们进一步发现突变体雌蕊中Bn SPT的表达量显著高于CK。(5)农杆菌介导的洋葱表皮瞬时表达的亚细胞定位分析显示,Bn SPT定位于洋葱表皮细胞的细胞核中,表明它在细胞核中发挥作用。(6)鉴于突变体Bn SPT的表达量显著高于CK的,我们进一步创建过表达转基因油菜植株进行表型观察。我们构建了Bn SPT的过表达载体,利用农杆菌介导的油菜下胚轴转化法,获得了3个Bn SPT的过表达株系,后续将对这三个株系的阳性转化株进行进一步的表型观察和相关研究。
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