论文部分内容阅读
犬瘟热是一种急性高度接触性传染病，引起犬科、猫科、浣熊科等多种动物发病，发病率几乎可达100％，易继发二次感染。本试验的目的之一是建立犬瘟热病毒荧光定量RT-PCR检测方法，检测CDV的感染情况，以便对犬瘟热能够进行更好的监控、预后和治疗评价；目前预防CD的疫苗是弱毒疫苗，但弱毒疫苗具有散毒，热不稳定，产生免疫抑制等现象，基因工程疫苗的研究为CD的预防指明了新的方向，本试验的目的之二是构建包含犬瘟热病毒N、F、H基因的真核表达载体，为CDV的DNA疫苗的研究奠定基础。 本试验根据犬瘟热病毒的核衣壳蛋白(N)基因保守序列，设计了一对特异性引物，通过RT-PCR扩增得到目的基因，经纯化回收后克隆到pMD18-T Simple载体，转化DH5α感受态细胞，挑取阳性菌落在LB(Amp+)培养基中摇菌，抽提质粒，经PCR和测序鉴定，即得到标准阳性质粒。在此基础上，建立犬瘟热病毒荧光定量RT-PCR检测方法，对该方法的敏感性、重复性、特异性进行分析。试验结果表明，该方法敏感性比普通RT-PCR高出100倍，重复性良好，变异系数在1.01％以下，对犬的常见病原等核酸提取物检测均为阴性，证明特异性良好，对临床上疑似犬瘟热的32份样本中，检测到27份阳性样本，高于普通RT-PCR方法，因此该方法可用于犬瘟热病毒感染的检测。 本试验以犬瘟热病毒广州分离株感染Vero细胞收获病毒提取的RNA为模板，根据GenBank上发表的(登录号AF305419.1)犬瘟热病毒N、F、H基因序列，设计3对特异性引物，分别在上下游引物的5’端加入酶切位点HindⅢ、EcoRⅠ、XhoⅠ；RT-PCR扩增得到目的基因，胶回收后克隆到pMD18-T Simple载体，转化DH5α感受态细胞，挑取阳性菌落在LB(Amp+)培养基中摇菌过夜，抽提质粒，经PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定为阳性；目的基因经双酶切后亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)，经PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定后，结果表明成功构建了pcDNA-N，pcDNA-F，pcDNA-H重组真核表达质粒。 大量提取、纯化重组真核表达质粒pcDNA-N，pcDNA-F，pcDNA-H，在脂质体介导下转染Vero细胞，通过RT-PCR和间接免疫荧光检测重组质粒在细胞的表达情况，结果表明N、F、H基因均在Vero细胞中成功的得到了瞬时表达。