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目的:ETV4属于ETS转录因子家族中PEA3亚家族成员,与多种恶性肿瘤细胞增殖与转移相关。课题组前期研究结果表明,ETV4作为重要癌基因,其高表达与非小细胞肺癌（Non-small-cell lung cancer,NSCLC）患者的进展及不良预后有关。为进一步揭示ETV4在NSCLC中的调控机制,我们利用Human m RNA表达谱芯片检测了敲低ETV4对NSCLC细胞基因表达的影响。芯片结果表明,伴随ETV4敲低后下调的基因参与细胞嘌呤、嘧啶代谢,细胞DNA复制,细胞周期,MAPK等重要信号通路的调控过程。本研究主要围绕ETV4对嘌呤代谢中关键基因-PPAT表达的调控作用,揭示ETV4调控嘌呤代谢参与NSCLC细胞增殖的作用机制。方法:1.细胞培养:使用1%青霉素/链霉素的双抗及10%胎牛血清的DMEM培养基培养贴壁生长的H1703、H1299和H358T细胞;H358T细胞是对H358细胞用TGF-β长期刺激后转化形成。此外用含10%透析血清的DMEM培养基培养细胞,作为去除外源性嘌呤的条件培养。2.细胞转染:利用si RNA瞬时转染H1703、H1299和H358T细胞,敲低细胞中ETV4、PPAT的表达。3.表达谱芯片检测:H1703、H1299及H358T细胞转染NC-si RNA,siETV4后进行芯片检测,由上海康城公司提供服务。4.RT-qPCR方法:检测ETV4嘌呤代谢相关基因在m RNA水平表达。5.Western Blot方法:检测敲低ETV4后嘌呤代谢关键基因在蛋白水平表达。6.报告基因构建与双荧光素酶检测:分析ETV4对PPAT基因启动子区的调控作用。7.染色质免疫共沉淀（Chip）方法:分析ETV4在PPAT基因启动子区的结合情况。8.MTT:检测瞬时敲低PPAT对NSCLC细胞增殖能力的影响。9.Transwell小室:检测瞬时敲低PPAT对NSCLC细胞迁移或侵袭能力的影响。10.克隆形成实验:检测敲低PPAT对细胞增殖能力的影响。11.流式细胞术（FCM）:观察敲低PPAT对NSCLC细胞周期分布的影响。12.代谢组学:分析敲低ETV4、PPAT对嘌呤代谢化合物的影响。13.统计分析:数据以平均±标准差（SD）表示,使用Graph Pad Prism软件对实验数据进行t检验、单因素方差分析（ANOVA）和双因素方差分析。SPSS13.0统计软件对实验数据应用卡方检验方法分析。P＜0.05时认为有统计学意义。结果:1.ETV4对NSCLC细胞嘌呤代谢相关基因表达的影响利用表达谱芯片检测了敲低ETV4对NSCLC细胞中基因表达的影响,KEGG分析表明,伴随ETV4敲低而显著下调的基因参与嘌呤代谢调节,包括PPAT、ENPP1、NME4、POLA2和POLA4等。PPAT作为嘌呤从头合成途径中第一个限速酶,其表达在ETV4敲低组显著降低（FC=2.068,p=0.019）,后续实验主要围绕ETV4-PPAT的调控进行研究。2.ETV4对PPAT基因表达的影响RT-PCR结果表明,与对照组相比,H1703、H1299和H358T细胞中ETV4敲低组PPAT m RNA表达均显著降低（all P＜0.05）。Western Blot结果进一步证明,伴随ETV4敲低后PPAT蛋白表达显著降低。3.ETV4转录调控PPAT基因的表达为了验证ETV4是否从转录水平调控PPAT的表达,我们进一步通过构建报告基因、双荧光素酶检测以及染色质免疫共沉淀方法进行分析。双荧光素酶检测结果表明,与对照组相比,ETV4质粒与Luc-PPAT报告基因载体共转染H358和HEK293T细胞可显著增加PPAT基因启动子活性（P＜0.001）。此外,在H358-ETV4细胞中,用anti-flag抗体通过Chip-PCR方法检测发现,外源性ETV4（flag标签）与PPAT基因启动子区结合。进一步在H1299细胞中利用anti-ETV4抗体Chip-PCR方法检测结果证实,内源性ETV4可以与PPAT的启动子相结合。以上结果表明,ETV4通过转录调控PPAT基因表达。4.敲低PPAT对NSCLC细胞增殖的影响在H1703、H1299和H358T细胞中敲低PPAT的表达,使用MTT比色法检测PPAT对细胞增殖的影响。与对照组相比,3个细胞中PPAT敲低组细胞的增殖能力均显著下降（all P＜0.01）。此外,克隆形成实验表明,PPAT敲低组细胞克隆形成能力显著降低（all P＜0.01）。5.敲低PPAT对NSCLC细胞周期进展的影响流式检测结果表明,敲低PPAT表达后,H1703、H1299以及H358T细胞中G0/G1期的细胞比例均显著增加（all P＜0.05）,引起细胞G0/G1期阻滞。6.PPAT对NSCLC细胞迁移和侵袭能力的影响Transwell小室结果表明,敲低H1703、H1299以及H358T细胞中P PAT后,细胞迁移、侵袭能力显著低于对照组细胞（all P＜0.05）。7.PPAT对NSCLC中嘌呤代谢组学的影响为进一步明确ETV4调控PPAT参与NSCLC细胞嘌呤代谢过程,我们进一步通过代谢组学检测了敲低ETV4、PPAT对嘌呤相关代谢产物的影响。结果表明,腺嘌呤核糖核苷酸（AMP）显著下降（all P＜0.01）。8.ETV4-PPAT-嘌呤代谢与mTOR通路活性有关。转染si-PPAT抑制H1703、H1299和H358T细胞中PPAT表达后,mTORC1下游效应分子p S6K水平显著下降,给予相应浓度的Adenine后,p S6K水平回复至对照组水平。结论:1.ETV4转录调控嘌呤代谢途径中关键基因PPAT表达,参与NSCLC细胞嘌呤代谢的调控过程。2.PPAT表达与NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭能力以及与细胞周期进展相关。3.ETV4-PPAT-嘌呤代谢与mTOR通路活性相关,提示嘌呤水平也是NSCLC细胞感知的重要代谢物之一。