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目的:肝细胞癌(HCC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。然而,肝癌进展的详细分子机制仍不完全清楚。恶性肿瘤的侵袭和迁移是其治愈率低、治疗效果差的主要原因。MicroRNA(miRNA)是一类单链非编码RNA分子,其存在于生理条件下并且长约19-25nt。它可以通过mRNA的编码区或非翻译区互补结合,直接与靶基因降解或抑制靶基因翻译过程调节靶基因的表达,属于转录后调控基因表达一类分子。由于其作为基因调节因子的重要性,microRNA可以在生理和病理过程中发挥重要作用,例如生物体发育和肿瘤发生。成纤维细胞生长因子受体(FGFR)属于免疫球蛋白基因超家族。它由胞外区、单次跨膜区和细胞质内的酪氨酸激酶区三个部分组成,可与成纤维细胞生长因子(fibroblast growthfactor,FGF)结合,通过各种不同的信号传递路径,对细胞的增殖、分化和转移进行调节。目前已克隆的FGF受体有FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FGFR5,其分布具有组织特异性,FGFR4是唯一存在于成熟静息状态肝细胞上的FGFR。成纤维细胞生长因子受体4(fibroblast growth factor receptor4,FGFR4)是成纤维细胞生长因子受体家族中较晚被发现的一类跨膜酪氨酸激酶受体。FGFR4通过与成纤维细胞生长因子结合,启动Ras、PLC等多条信号转导途径,参与调控胚胎发育、创伤愈合、血管生成、组织分化和修复等多种生理过程,在胚胎组织和一些生长活跃的组织内中有着较高的表达,并且在许多肿瘤组织内会出现过表达,已成为癌症前期极好的预测因子和基因治疗的有效靶点。鉴于microRNAs(miRNAs)在肿瘤转移中的至关重要的作用,我们的目的是分析一个被命名为miR-340的转移相关miRNA在HCC中的表达和功能:(1)预测与FGFR4结合的miRNA,并筛选与FGFR4表达负相关的miRNA。(2)验证此miRNA与FGFR4的3’-UTR的特异性结合。(3)研究miRNA表达对人肝癌细胞株生物学特性的影响。(4)考察miRNA在肝癌及癌旁组织中的表达及与FGFR4表达的相关性。 方法:利用miRNA生物信息学预测数据库分析,寻找肝癌转移相关的miRNA。利用RT-PCR检测miR-340在病人的肿瘤组织和癌旁肝组织中以及肝癌细胞系中的表达。利用荧光素酶报告检测实验验证作用于FGFR4的miRNA。利用慢病毒转染方法构建miR-340过表达和低表达细胞系。利用western blot检测FGFR4表达水平。利用transwell小室实验检测肝癌侵袭和迁移。利用CCK-8法测定细胞凋亡。 结果:通过三个常用的miRNA生物信息学预测数据库预测与FGFR4相互作用的miRNAs,我们得到3个miRNA:miR-330-5p,miR-340,miR-3613-5p。根据RT-PCR和前期Western blot的结果,我们选择miR-340作为进一步研究的对象。成功构建HepG2-miR-340up、Hep3B-miR-340down实验组以及其相应的阴性对照空载体质粒组。结合荧光素酶报告实验的结果,确认了miR-340可以与FGFR4特异性结合。通过慢病毒转染方法构建miR-340过表达和低表达细胞系,通过western blot实验,证明miR-340与FGFR4呈负相关。CCK-8结果表明,miR-340对于肝癌细胞的增殖具有一定的抑制作用。对肝癌病人癌组织石蜡切块中miR-340的测定显示,其肝癌病人中的表达量远远低于正常人,且肝癌区的表达量低于癌旁正常组织。 结论:成纤维细胞生长因子受体4(FGFR4)表达在肝癌中显著升高,其表达水平与多发结节、微血管侵袭、肝癌的总生存率和无病生存率高度相关。miR-340在肝癌细胞中的异常表达会在很大程度上影响FGFR4的表达。通过实验,我们可以确认miR-340能够与FGFR4特异性结合,并对FGFR4的表达具有调控作用。miR-340过表达显著抑制FGFR4的表达,而miR-340低表达可使FGFR4表达升高,二者存在较为显著的负相关性。这些研究结果共同证明miR-340可以靶向调控FGFR4在正常及肝癌细胞中的表达,这表明miR-340可能作为肝癌的一个潜在的预后生物标志物和治疗靶点。