肝细胞癌（HCC）是在世界范围内最普遍,致死率位居第二的恶性肿瘤,严重危害人类的健康,目前尚缺乏有效治疗手段。我国是肝癌的高发区,而且肝癌的发病率也在逐年递增,因此寻求有效肝癌防治策略的研究具有重要的科学价值和社会意义。肝癌一般是由肝炎病毒引起的慢性肝炎和肝硬化转化而来,并且在病变过程中常伴随CyclinD1的过表达,促进CDK4的活化,促进肝细胞增殖。Cyclin D1基因的过度表达与包括肝癌在内的多种肿瘤的发生、发展、预后密切相关,已确定为一种重要的癌基因,是肿瘤治疗的重要靶点。单链抗体是具有抗原结合活性的小抗体片段。具有分子小,易于进入组织细胞,免疫原性小,易于大量生产和工程修饰等特点,具有较好的应用前景。尤其是新兴的胞内抗体技术通过对scFv的N端或C端进行修饰后可以特异性地干扰或阻断细胞内重要靶蛋白的活性和功能,使得单链抗体显现出巨大的应用潜能。本实验室前期工作中以Cyclin D1为靶点,筛选到了能特异性结合Cyclin D1蛋白的人源单链抗体AD9,并且采用胞内抗体技术,制备了基于AD9内质网滞留型抗Cyclin D1胞内抗体ER-ADκ。研究发现,内质网滞留型抗Cyclin D1胞内抗体,能在细胞内结合并抑制CyclinD1活性,抑制乳腺癌等肿瘤细胞增殖,诱导细胞凋亡,抑制肿瘤细胞迁移。但该胞内抗体能否有效抑制肝癌细胞的增殖,目前尚不清楚。另外该抗体是如何与抗原相互作用,进而如何改变CyclinD1的下游信号传递,抑制肿瘤细胞增殖的分子机制均有待于进一步揭示。为此,本论文就抗CyclinD1胞内抗体的肝癌生长抑制效应及其分子机制开展了相关研究,取得如下结果:首先通过细胞实验和动物模型实验,探究内质网滞留型抗CyclinD1胞内抗体的体内外抑制肝癌生长和增殖效应。结果表明,ER-ADκ能有效结合细胞内的CyclinDl蛋白,引起HepG2细胞周期G1/S期阻滞,诱导HepG2细胞的凋亡,并且pBg-ER-ADK治疗后显著抑制裸鼠异体移植瘤体的生长。其次通过噬菌体随机肽库筛选、计算机模拟结合突变验证实验分析,确定抗原抗体相互作用模式及关键氨基酸,揭示抗原抗体相互作用的分子基础。噬菌体随机肽库筛选确定的模拟表位与Cyclin D1的29-33,93-96,111-114位氨基酸具有高度同源性,Cyclin D1缺失突变体实验表明,AD9与Cyclin D1的相互作用表位分布在N-末端1-120位氨基酸之间。并且通过计算机辅助的同源建模和分子对接发现抗原抗体相互作用的关键氨基酸为Asn24,Lys33,Lysl12,Met113,Lys114,Glu115,这些位点的定点突变也证明除Glu115外,其余氨基酸位点均参与了 Cyclin D1与AD9的结合,并且Lys112在其中担任着极其重要的作用。由此,我们猜测ER-ADκ抑制细胞增殖可能是通过阻碍Cyclin D1通过Lys112与CDK4的结合实现的。最后通过肿瘤细胞内抗原抗体相互作用分析,验证关键氨基酸及关键分子的作用,初步提出抗Cyclin D1胞内抗体抑制肿瘤细胞增殖的分子机制。HepG2细胞的免疫共沉淀实验结果表明,ER-ADκ能抑制Cyclin D1与CDK4的结合,降低pRB蛋白的磷酸化水平,实时定量PCR结果显示,ER-ADκ的表达下调CDK1,CDK4,IL-6,gp130,Bcl-2,c-Met,survivin等促进细胞增殖的相关基因的表达水平,并上调p21,p27,p53等抑制细胞增殖的相关基因的mRNA水平。综上所述实验结果,ER-ADκ通过与Cyclin D1的结合抑制CDK4的结合和激酶活性,抑制pRB的招募和磷酸化,从而影响下游一系列细胞增殖调控基因表达水平的改变,抑制肝癌细胞的生长和增殖。本项研究为以Cylin D1为靶点的抗Cyclin D1胞内抗体肿瘤临床治疗提供了实验依据。