乳腺癌是全球女性最常见的癌症类型,亦是我国女性发病率最高、引起癌症相关性死亡的主要病因。三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)是一种缺乏雌激素受体、孕激素受体和表皮生长因子受体2表达的特殊类型乳腺癌,具有高侵袭性、高转移性和显著耐药性等特点。TNBC发病率占乳腺癌总发病率的20%,死亡率占乳腺癌总死亡率的83%,与其他类型的乳腺癌相比,TNBC患者的愈后差、远期生存率低,目前TNBC尚无标准的治疗方案。因此开展三阴性乳腺癌的新型治疗策略及分子机制的研究具有重要的科学意义和临床应用价值。Cyclin D1是由CCND1基因编码的细胞周期蛋白,具有促进细胞增殖和基因转录等功能,可在多种癌症中呈高表达。现有研究表明,阻断Cyclin D1的治疗策略将有助于干扰多种癌症特异性信号通路达到癌症治疗的目的。但是Cyclin D1在三阴性乳腺癌中的表达及其与愈后的关系尚存在争议,且Cyclin D1在TNBC发生、发展中的作用机制尚未明确。因此,深入研究TNBC中Cyclin D1的表达以及靶向拮抗Cyclin D1的作用效能,对于进一步理解TNBC发生和发展的分子机制,改善TNBC的治疗效果具有重要意义。胞内抗体技术是在细胞内表达且作用于同一细胞内靶抗原的具有功能的抗体分子,通过阻断或调节靶蛋白的活性,在翻译后水平实现蛋白质的敲低,作为RNA干扰(RNAi)和小分子抑制剂等靶分子敲低技术的互补手段,在蛋白质功能的研究中发挥重要作用。越来越多的研究表明,可以通过对胞内抗体进行工程化修饰等手段,将抗体蛋白定位于细胞各区间内,从而在多种疾病(例如病毒感染、退行性疾病和肿瘤)中发挥诊断和治疗作用。本实验室前期工作中构建了内质网滞留型抗Cyclin D1胞内抗体(命名为ER-ADκ),能够在ER阳性乳腺癌及肝癌细胞内结合并抑制Cyclin D1活性,有效抑制MCF-7、Hep G2等肿瘤细胞系增殖并诱导细胞凋亡的发生。但ER-ADκ能否在TNBC中发挥抑制肿瘤生长及转移的作用尚不清楚。因此,为了深入研究TNBC中Cyclin D1的致癌机制以及ER-ADκ能否作为改善TNBC患者愈后的有效治疗策略,本研究拟通过分析GEO数据库中TNBC患者m RNA转录组学数据,明确CCND1在TNBC组织中的转录水平及可能参与调控的信号通路,利用胞内抗体技术识别并结合TNBC细胞内Cyclin D1后,分别在细胞水平及裸鼠体内探究ER-ADκ的表达对三阴性乳腺癌生长、转移之间的关系及具体分子机制。主要研究结果如下:一、明确Cyclin D1在TNBC癌和癌旁组织中的表达特性。通过GEO数据库下载TNBC患者m RNA芯片数据并利用R语言进行生物学分析,研究结果表明,CCND1在TNBC组织中呈高表达,通过STRING网站行PPI网络构建、通过R语言行GO功能注释及KEGG富集通路分析发现,Cyclin D1在TNBC中参与调控细胞周期、细胞衰老、乳腺癌的发生以及在PI3K-AKT、Wnt等信号通路中发挥作用。乳腺癌组织芯片的免疫组织化学染色实验进一步证实:Cyclin D1在TNBC组织中的表达高于癌旁组织,预示Cyclin D1可能成为TNBC靶向治疗的分子靶点。二、证实抗Cyclin D1胞内抗体(ER-ADκ)能够有效抑制TNBC增殖和转移,促进TNBC凋亡。(1)在MDA-MB-231和BT-549两种TNBC细胞中转染ER-ADκ的质粒,进行Western blot、co-IP和间接免疫荧试验,结果表明,ER-ADκ在TNBC中成功表达并定位在细胞内质网;(2)流式细胞术分析结果表明:ER-ADκ能诱导MDA-MB-231细胞发生G1/S期细胞周期阻滞和细胞凋亡;(3)细胞划痕试验、Transwell小室等实验发现,ER-ADκ能抑制MDA-MB-231和BT-549细胞的迁移、侵袭和浸润能力。三、探究ER-ADκ抑制TNBC发生发展中的分子机制。结果表明:(1)TNBC细胞中,ER-ADκ抑制成视网膜细胞瘤抑癌蛋白(Retinoblastoma Protein,Rb)磷酸化水平,并上调抑制细胞周期相关因子p21(Cyclin inhibition protein 1)、p27(Kinase inhibition protein 1)的转录,进而抑制TNBC细胞周期进程;(2)ER-ADκ通过内质网应激途径,促进TNBC细胞发生凋亡;(3)ER-ADκ通过抑制β-catenin的核易位,下调TNBC细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程相关转录因子Slug、Snail的表达,抑制EMT相关蛋白N-钙黏着蛋白(N-cadherin)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)2、MMP9和MMP14的表达,并提高E-钙黏着蛋白(E-cadherin)的表达,从而抑制细胞上皮-间质转化,抑制TNBC的转移。四、ER-ADκ抑制TNBC生长及转移的体内效应及相关机制分析。结果表明:(1)通过裸鼠异种移植瘤实验发现,ER-ADκ可以在体内显著降低MBA-MB-231细胞的瘤重及瘤体积,有效抑制MDA-MB-231细胞的体内生长;ER-ADκ通过激活内质网应激的方式在体内诱导细胞凋亡的发生。(2)通过裸鼠异种移植瘤实验和尾静脉注射肺转移模型发现,ER-ADκ能够在体内有效抑制三阴性乳腺癌细胞肺转移的能力;ER-ADκ促进E-cadherin表达、抑制β-catenin表达降低癌细胞肺转移的能力。通过以上研究,我们发现Cyclin D1在TNBC组织中呈高表达,并对TNBC细胞增殖、凋亡、迁移及浸润等过程起着重要的作用。通过在MDA-MB-231和BT-549两种三阴性乳腺癌细胞系内表达抗Cyclin D1的胞内抗体ER-ADκ,能够在细胞内识别并结合Cyclin D1,抑制三阴性乳腺癌细胞在体内和体外的增殖及转移能力,其分子机制可能是通过ER-ADκ结合并抑制Cyclin D1活性,下调Rb磷酸化水平,诱导内质网应激介导细胞凋亡的发生,并减少β-catenin的核累积,进而使EMT过程受阻,从而抑制TNBC生长和转移。综上,本研究首次通过胞内抗体技术实现敲低TNBC中的Cyclin D1,发现抗Cyclin D1胞内抗体能够显著抑制TNBC细胞的生长和转移,并探讨了相应的机制,为Cyclin D1作为三阴性乳腺癌治疗靶点提供了实验依据,并为胞内抗体作为新型抗肿瘤药物的研发奠定基础。