目的:由于现代饮食结构改变,营养过剩引起的肥胖已成为世界范围的流行病,严重危害人类健康。中医认为营养性肥胖是由于饮食肥甘厚腻之品导致湿浊内生,痰湿积聚成形成肥胖。治宜芳香化湿,其代表药物有藿香、佩兰。为研究芳香化湿药藿香、佩兰的“化湿”作用及其作用机制,本论文将对芳香化湿药藿香、佩兰干预营养性肥胖大鼠的降脂作用和机制及其对骨髓间充质干细胞成脂分化的影响进行初步的探讨。方法:1.采用高脂饲料诱导的方式建立营养性肥胖大鼠模型60只SPF级SD大鼠,体重120±10g,适应性喂养1周。应用随机函数按大鼠体重进行分组,分为正常组10只、造模组50只,正常组喂以普通饲料,造模组喂以进口高脂饲料,动态监测大鼠的体重、体长。喂养4周后检测大鼠血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(CHOL)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、葡萄糖(GLU)含量。以造模组大鼠的体重、Lee’s指数、血清TG含量为依据,建立营养性肥胖大鼠模型。2.藿香、佩兰干预营养性肥胖大鼠模型生理生化指标的检测模型建立成功后,造模组按体重及血清TG含量随机分为模型组、藿香高、低剂量组,佩兰高、低剂量组。藿香、佩兰低剂量组灌胃剂量为3g/kg·d,藿香、佩兰高剂量组灌胃剂量为6g/kg·d(混合挥发油,按2015版《中国药典》用量根据体表面积方法换算大鼠剂量),药物干预4周。正常组、模型组给予同体积的生理盐水。药物干预过程中,每周监测大鼠的体重、体长。药物干预4周后,腹腔麻醉,腹主动脉取血,检测大鼠血清中TG、CHOL、HDL-C、LDL-C、GLU含量。3.应用代谢组学研究方法研究藿香、佩兰干预营养性肥胖大鼠发挥降脂作用的内源性差异化合物的变化及其发挥作用的代谢途径。药物干预4周后,分别提取各组大鼠血清样品50μL,置于1.5m L EP管中,加入甲醇150μL,涡旋1min,完成后将血清样本在4℃冰箱中静置3h,并离心10min(15,000 rpm,4℃),提取上清液,氮吹,用100μL的甲醇溶液(甲醇:水=15:85)来溶解剩余残渣,样品涡旋1min,离心15min(18,000rpm,4℃),取上清液用安捷伦高效液相质谱仪分析,查找差异化合物及其发挥作用的代谢途径。4.应用转录组学研究方法研究藿香、佩兰干预营养性肥胖大鼠差异基因的表达药物干预4周,大鼠腹腔麻醉,取出动物肝脏,在冰盒上剪去肝脏表面部分,取肝脏内部组织迅速分成若干份,放入装有RNA保护液的冻存管中,转移至-80℃冰箱保存备用。Tizol法提取总RNA,交由华大基因公司进行检验,查找各组差异表达基因。5.藿香、佩兰含药血清对骨髓间充质干细胞的成脂分化的影响(1)藿香、佩兰各500g,提取药汁,接挥发油,浓缩至1g/m L;SPF级SD大鼠70只,体重180±20g,分为正常组、藿香、佩兰给药组。灌胃7天,灌胃剂量为3g/kg·d,腹主动脉取血,分离血清-20℃保存。(2)SD大鼠取骨髓间充质干细胞,培养至4代,进行流式鉴定。(3)诱导剂A的配置:培养基中依次加入吲哚美辛、IBMX、胰岛素、地塞米松(终浓度分别为60μmol/L、500μmol/L、10mg/L、1μmol/L);诱导剂B的配置:培养基中加入胰岛素、罗格列酮(终浓度分别为10mg/L、1μmol/L)。(4)实验分为7个实验组,正常组,模型组、1.25%、2.5%、5%、10%、15%的藿香、佩兰含药组,诱导剂A诱导3天,诱导剂B维持,持续21天,进行油红O染色、萃取,细胞TG含量检测。结果:1.高脂饲料诱导的方式造模4周,第2周开始造模组动物体重增长明显高于正常组(P<0.01),第3周开始Lee’s指数也显著高于正常组(P<0.01)。造模第4周体重、Lee’s指数、血清中TG、GHOL、HDL-C、LDL-C、GLU的含量均明显高于正常组(P<0.01),营养性肥胖大鼠模型建立成功。2.芳香化湿药佩兰干预营养性肥胖大鼠模型,与模型组相比,佩兰高、低剂量组大鼠的体重、Lee’s指数并没有明显改善(P>0.05),佩兰低剂量组大鼠血清中TG、CHOL、LDL-C、GLU含量明显下降(P<0.05),HDL-C含量明显上升(P<0.01);佩兰高剂量组,大鼠血清中TG含量明显下降(P<0.01),GHOL、HDL-C、LDL-C、GLU含量无明显变化(P>0.05)。3.基于代谢组学分析发现:佩兰干预营养性肥胖大鼠模型,查找出12种潜在生物标记物分别是:赖氨酸、精氨酸、色氨酸、脯氨酸、瓜氨酸、泛酸、吲哚丙烯酸、吲哚乙醛、二氢神经鞘氨醇、皮质酮、孕烯醇酮、植物鞘氨醇等,这12种差异化合物主要通过色氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、鞘脂代谢3种代谢途径发挥作用。4.基于转录组学分析发现:佩兰干预营养性肥胖大鼠模型主要通过介导PPAR信号通路、脂肪酸代谢胰岛素信号通路、甘油脂代谢、调节脂肪细胞中的脂肪分解、脂肪酸生物合成柠檬酸循环(TCA循环)等代谢途径,下调Fasn、Igfbp1基因的表达;上调Acly、Socs2等基因的表达发挥降脂作用。5.芳香化湿药藿香干预营养性肥胖大鼠模型,与模型组相比,藿香高、低剂量组的体重、Lee’s指数及血清中CHOL、HDL-C、LDL-C、GLU无明显改变(P>0.05),但藿香高、低剂量组血清中TG含量明显下降(P<0.01),且藿香高剂量组具有明显降低GHOL的趋势。6.基于代谢组学分析发现:藿香干预营养性肥胖大鼠模型,查找出10种内源性潜在生物标记物,分别是:神经酰胺、植物鞘氨醇、胞嘧啶、吲哚丙烯酸、泛酸、蛋氨酸、色氨酸、酪胺、酪氨酸、尿素等,这10种差异化合物主要通过苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成,氨酰基-t RNA生物合成,酪氨酸代谢,鞘脂代谢4种代谢途径发挥降脂作用。7.基于转录组学分析发现:藿香干预营养性肥胖大鼠模型主要通过介导PPAR信号通路、脂肪酸代谢、胰岛素信号通路等26种代谢途径下调Fasn、Ppp1r3b,上调Scd、Socs2表达发挥降脂的作用。8.通过细胞油红染色、萃取及细胞TG含量检测发现:5%、10%、15%佩兰含药血清组具有明显抑制BMSCs成脂分化的作用,各组间无明显浓度梯度的关系;15%藿香含药血清组具有一定的降低BMSCs成脂分化的作用,但对细胞TG含量无明显抑制作用。结论:芳香化湿药物藿香、佩兰干预由饮食肥甘厚腻之品导致湿浊内生,痰湿积聚形成的营养性肥胖,具有一定的降脂作用。其作用机制可能是通过干预氨基酸代谢、脂质代谢等代谢途径,下调Fasn、上调Socs2基因的表达,抑制甘油三酯、脂肪酸、胆固醇的合成,抑制前脂肪细胞的成脂分化,减轻胰岛素抵抗等途径发挥“化湿”降脂作用,干预营养性肥胖的发生、发展。此外,藿香、佩兰动物含药血清具有一定的抑制BMSCs成脂分化的作用,其具体的作用机制有待于进一步研究。本实验研究表明机体内的脂质含量是中医“内湿”的表征之一,芳香化湿药物藿香、佩兰可能通过脂代谢途径发挥化湿作用。