论文部分内容阅读
PI3K/Akt/m TOR信号通路是受生长因子调控的最重要的细胞内网络通路之一,调节着细胞存活、代谢、生长、增殖等多种生命活动。相关研究证实了该通路上的关键调控位点PI3K和m TOR与肿瘤的发生、发展密切相关,因此基于PI3K、m TOR这两个靶点的抗肿瘤药物的研发成为药物化学领域的研究热点。本论文根据文献报道的PI3K抑制剂的结构特征,选取GDC-0941为先导化合物。根据GDC-0941与PI3Kα的分子对接模拟结果和多篇PI3K抑制剂相关的文献资料检索分析,可以发现PI3Kα蛋白空腔中可以容纳多种类型核心,结果表明在ATP结合位点内有足够的空间对GDC-0941的母核噻吩并[3,2-d]嘧啶进行骨架跃迁。基于以上研究和分析,对先导化合物进行以下改造:（1）根据骨架跃迁、生物电子等排原理等原理,将GDC-0941的噻吩并[3,2-d]嘧啶母核进行骨架跃迁,并且引入与嘧啶环相似的三嗪环,设计合成了第一系列2-芳基-4-吗啉取代的噻吩联三嗪类化合物,共30个目标化合物。（2）选取最优化合物ZBL-23进行进一步的优化和改造。为了提高目标化合物的m TOR激酶活性,运用拼合原理,将m TOR抑制剂关键药效团“脲片段”拼接到化合物ZBL-23上,设计合成了第二系列取代烷基芳基脲-4-吗啉取代的噻吩联三嗪类化合物,共32个目标化合物。采用MTT法,以A549、Hela、MCF-7为测试细胞株,以GDC-0941为阳性对照化合物,对设计合成的62个化合物进行体外肿瘤细胞增殖抑制活性筛选。结果表明,第一系列的化合物对A549、MCF-7和Hela表现出中等到强的抗肿瘤活性。其中化合物ZBL-23表现出优异的抗肿瘤活性,对A549,MCF-7和Hela细胞株的抗肿瘤活性(IC50)分别为0.20±0.05μM、1.25±0.11μM和1.03±0.24μM,活性优于先导化合物GDC-0941。第二系列的化合物对A549、MCF-7和Hela表现也出中等到强的抗肿瘤活性,其中化合物ZBL-39表现出优异的抗肿瘤活性,对MCF-7、Hela和A549细胞株的抗肿瘤活性(IC50)分别为0.12±0.07μM、0.39±0.81μM和2.85±0.71μM,活性优于先导化合物GDC-0941。根据抗肿瘤性测试结果,挑选出抗肿瘤性较优的化合物进行PI3Kα和m TOR的激酶抑制活性测试和再进一步的激酶选择性测试,数据显示第一系列化合物ZBL-21、ZBL-23和第二系列化合物ZBL-31、ZBL-39被鉴定为选择性PI3Kα/m TOR双重抑制剂,对PI3Kα激酶的抑制活性IC50值分别为9.5 n M、7.0n M、22 n M和11 n M;对m TOR激酶的抑制活性IC50值分别为69 n M、48 n M、29 n M和32 n M,比先导化合物GDC-0941的m TOR激酶活性提高了7～48倍。对第一系列化合物ZBL-23进行深入研究:流式细胞周期凋亡和AO染色测试,结果表明化合物ZBL-23能够促进诱导A549细胞凋亡,并且能够阻滞A549细胞周期在G0/G1期。还对ZBL-23进行了蛋白质印迹试验,结果表明ZBL-23能够有效地抑制p-AKT（S473）和p-GSK3β的磷酸化。对第二系列化合物ZBL-39进行了深入研究:通过裸鼠MCF-7细胞移植瘤模型考察在裸鼠体内的抗肿瘤活性,数据显示ZBL-39高剂量治疗组移植瘤体积和平均瘤重均显著小于空白对照组,抑瘤率为42.1%。与此同时,ZBL-39高剂量治疗组的荷瘤小鼠体重在给药初期部分发生轻微的降低,但随着治疗时间的延长,荷瘤小鼠的体重逐渐恢复,实验结束时与空白对照组相比并无显著性差异,且未见明显的毒性反应。通过免疫组化检测裸鼠MCF-7细胞移植瘤中Ki67、caspase-3、cyt-c、p65蛋白和Bcl-2基因的表达情况,数据显示与空白对照组相比,ZBL-39高剂量治疗组的Ki67蛋白表达降低,而Bcl-2、caspase-3、cyt-c和p65的表达均升高,说明化合物ZBL-39能够诱导MCF-7细胞移植瘤凋亡。基于化合物抗肿瘤活性研究及分子对接结果,化合物的构效关系归纳如下:（1）吗啉环能够很好嵌入到PI3Kα、m TOR蛋白的铰链区,并与Val851、Val2240形成关键的氢键,是维持化合物生物活性的关键片段之一;（2）在噻吩环引入的仲胺伸向空腔的溶剂区并与Gln859、Arg2251形成潜在的氢键,其中吗啉环和甲磺酰基哌嗪的引入有利于化合物生物活性的增强;（3）2位取代的芳基深入蛋白的亲和口袋,并与多个氨基酸残基形成氢键,此部分引入含有氢键受体/供体原子的2-氨基嘧啶基团及甲基苯基脲基团最有利于改善化合物的活性。综上所述,本论文以GDC-0941为先导化合物修饰改造得到了2个系列62个结构新颖的噻吩联三嗪类PI3K/m TOR双重抑制剂,并对其构效关系及作用机制进行了初步分析及探讨,为今后该类抑制剂的深入研究奠定了基础。