基于miR-139-5p/FoxO1/Keap1/Nrf2通路探讨人参皂苷Rd对脑缺血再灌注损伤后细胞焦亡的影响及机制

来源 :新疆医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:gmwang2009
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目的:缺血性脑卒中是以脑循环血流量减少为特征的脑血管疾病,以其发病率高、致残率高及病死率高已成为威胁人类健康的“三大杀手”之一。近年来研究表明,脑缺血再灌注损伤可能与神经元发生细胞焦亡有关。人参皂苷Rd能够保护神经元免受脑缺血后再灌注损伤,但其具体的保护机制较为复杂,目前尚未完全阐释清楚。因此,本研究以细胞焦亡为切入点,从体内和体外两个层面探讨人参皂苷Rd对脑缺血再灌注损伤的作用机理,为把人参皂苷Rd开发成有效的抗脑缺血神经保护剂提供科学理论依据。方法:1、体内实验:取6-8周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠随机分为7组:假手术组(Sham)、脑缺血再灌注组(MCAO/R)、人参皂苷Rd低剂量组(10mg/kg)、人参皂苷Rd中剂量组(20 mg/kg)、人参皂苷Rd高剂量组(40 mg/kg)、人参皂苷Rd(40 mg/kg)+Nrf2抑制剂(ML385)组、人参皂苷Rd(40 mg/kg)+mi R-139-5p拮抗剂(mi R-139-5p antagomir)组,每组96只。除Sham组外,其余各组采用线栓法建立小鼠大脑中动脉闭塞/再灌注(MCAO/R)模型。人参皂苷Rd干预组分别在造模前30 min腹腔注射低、中、高剂量人参皂苷Rd。人参皂苷Rd+Nrf2抑制剂组在给予40 mg/kg人参皂苷Rd干预的基础上造模前90 min经腹腔注射30 mg/kg ML385。人参皂苷Rd(40 mg/kg)+mi R-139-5p拮抗剂组在给予40 mg/kg人参皂苷Rd干预的基础上在造模前3天经侧脑室内注射mi R-139-5p antagomir。再灌注24 h后,采用Longa神经评分系统对小鼠神经功能缺陷进行评分,TTC染色测定脑梗死百分比,计重法测定脑含水量,Nissl染色测定脑皮层组织神经元的形态学变化,免疫荧光法测定脑皮层组织细胞焦亡的情况,DCFH-DA荧光探针法检测脑皮层组织内ROS的含量,免疫荧光法检测脑皮层组织内NLRP3与TXNIP的共定位情况,RT-PCR检测脑皮层组织内mi R-139-5p、Fox O1、Keap1、NLRP3、ASC、Caspase-1 m RNA表达水平,Western blot检测脑皮层组织内Fox O1、Keap1、总Nrf2、核内Nrf2、HO-1、NQO1、Trx1、NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD的蛋白表达水平,ELISA法检测脑组织内炎症因子IL-18和IL-1β的分泌水平。2、体外实验:无菌条件下,从怀孕18天的C57BL/6孕鼠胚胎中提取原代皮层神经元,正常培养1周后将神经元随机分为10组:对照组(Control)、模型组(OGD/R)、人参皂苷Rd低剂量组(5μM)、人参皂苷Rd中剂量组(10μM)、人参皂苷Rd高剂量组(20μM)、人参皂苷Rd(20μM)+Fox O1过表达质粒(pc DNA3.1-Fox O1)转染组、pc DNA3.1-Fox O1转染组、Fox O1-sh RNA慢病毒载体转染组、mi R-139-5p模拟物(mi R-139-5p mimic)转染组、mi R-139-5p抑制物(mi R-139-5p inhibitor)转染组。采用MTT法检测细胞活力,LDH法检测细胞损伤,流式细胞术检测神经元焦亡水平,DCFH-DA荧光探针法检测神经元内ROS的含量,免疫共沉淀法(Co-IP)检测神经元内NLRP3与TXNIP的相互作用,RTPCR检测神经元内mi R-139-5p、Fox O1、Keap1、NLRP3、ASC、Caspase-1 m RNA表达水平,Western blot检测神经元内Fox O1、Keap1、总Nrf2、核内Nrf2、HO-1、NQO1、Trx1、NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD的蛋白表达水平,ELISA法检测细胞上清液中炎症因子IL-18和IL-1β的分泌水平,双荧光素酶报告基因验证mi R-139-5p靶向负调控Fox O1,染色质免疫共沉淀法(Ch IP)检测Fox O1与Keap1基因启动子区域的结合水平。结果:体内实验:1、不同剂量(10、20、40 mg/kg)人参皂苷Rd干预后可显著改善小鼠神经功能缺陷,明显降低脑梗死体积和脑水肿比例,并改善脑组织皮层神经元的损伤情况,使其形态恢复与假手术组近似。其中,40 mg/kg人参皂苷Rd效果最佳。2、不同剂量(10、20、40 mg/kg)人参皂苷Rd干预后可显著降低小鼠脑组织内神经元焦亡比例、焦亡相关蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1 p20、GSDMDN的蛋白表达水平、IL-18和IL-1β的分泌水平、细胞内ROS的含量以及TXNIP与NLRP3的共定位水平。其中,40 mg/kg人参皂苷Rd效果最佳。3、不同剂量(10、20、40 mg/kg)人参皂苷Rd干预后可明显下调小鼠脑组织内Keap1的m RNA及蛋白表达水平,且显著上调Nrf2的核转位水平以及Nrf2下游HO-1、NQO1、Trx1的蛋白表达水平。其中,40 mg/kg人参皂苷Rd效果最佳。4、使用Nrf2抑制剂ML385后,40mg/kg人参皂苷Rd对细胞焦亡比例、焦亡相关蛋白表达水平、IL-18和IL-1β分泌水平、细胞内ROS含量、TXNIP与NLRP3共定位水平的抑制作用被ML385逆转。5、人参皂苷Rd呈剂量依赖性方式上调mi R-139-5p的表达水平,但MCAO/R小鼠经侧脑室内注射mi R-139-5p antagomir后,40 mg/kg人参皂苷Rd对细胞焦亡、焦亡相关蛋白表达水平、IL-18和IL-1β分泌水平、细胞内ROS含量、TXNIP与NLRP3共定位水平的抑制作用被mi R-139-5p antagomir逆转。体外实验:1、不同浓度(5、10、20μM)人参皂苷Rd处理后可显著改善原代皮层神经元的细胞活力,并明显降低神经元的细胞损伤水平。其中,20μM人参皂苷Rd效果最好。2、不同浓度(5、10、20μM)人参皂苷Rd处理后可显著降低神经元细胞焦亡比例、焦亡相关蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1 p20、GSDMD-N的蛋白表达水平、IL-18和IL-1β的分泌水平、细胞内ROS的含量以及TXNIP与NLRP3的相互作用。其中,20μM人参皂苷Rd效果最好。3、不同浓度(5、10、20μM)人参皂苷Rd处理后可明显下调神经元内Keap1的m RNA及蛋白表达水平,且显著上调Nrf2的核转位水平以及Nrf2下游HO-1、NQO1、Trx1的蛋白表达水平。其中,20μM人参皂苷Rd效果最好。4、人参皂苷Rd呈剂量依赖性方式上调mi R-139-5p的表达水平。Mi R-139-5p mimic可明显提高神经元的细胞活力,并显著降低神经元细胞损伤、细胞焦亡比例、焦亡相关蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1 p20、GSDMD-N蛋白表达水平、IL-18和IL-1β分泌水平、细胞内ROS的含量以及TXNIP与NLRP3的相互作用。同时,Mi R-139-5p mimic可靶向负调控Fox O1,即明显降低Fox O1 m RNA及蛋白表达水平。然而,Mi R-139-5p inhibitor的作用恰好与mi R-139-5p mimic相反。5、过表达Fox O1的神经元内Keap1的m RNA和蛋白表达水平明显升高,Nrf2的荧光酶活性以及HO-1 HO-1、NQO1、Trx1蛋白表达水平明显降低,且Fox O1与Keap1启动子区域的结合水平明显增强。然而,沉默神经元内Fox O1后与上述情况相反。5、过表达Fox O1可明显逆转20μM人参皂苷Rd对Keap1表达的下调作用以及对Nrf2核转位水平及其下游基因HO-1、NQO1、Trx1表达的上调作用。此外,过表达Fox O1可逆转20μM人参皂苷Rd对细胞焦亡相关蛋白表达水平、IL-18和IL-1β分泌水平、细胞内ROS含量、细胞焦亡比例、TXNIP与NLRP3相互作用的抑制作用。结论:人参皂苷Rd对脑缺血再灌注损伤后神经元具有保护作用,并且此作用与上调mi R-139-5p表达水平,降低Fox O1与Keap1表达水平,进而激活Nrf2抗氧化信号通路,抑制ROS-TXNIP-NLRP3炎症小体轴诱导的细胞焦亡有关。
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