【摘 要】
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目的:本研究试图通过网络药理学探索三棱-莪术对结肠癌治疗的作用途径。通过体内外实验研究莪术挥发油对肿瘤血管的作用及其抑制模型裸鼠结肠癌肿瘤的效果。本实验希望能够为中医活血化瘀药物治疗肿瘤提供实验依据。方法:以三棱-莪术配伍为研究对象,结肠癌为疾病对象,运用网络药理学的方法探索三棱-莪术配伍的主要活性成分,治疗结肠癌潜在作用靶点以及药物在疾病过程中发挥的生物学效应。体外实验将HUVEC细胞实验分为空
【基金项目】
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国家自然基金项目（No.81673878）; 四川省青年创新团队项目（2020JDTD0022）
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目的:本研究试图通过网络药理学探索三棱-莪术对结肠癌治疗的作用途径。通过体内外实验研究莪术挥发油对肿瘤血管的作用及其抑制模型裸鼠结肠癌肿瘤的效果。本实验希望能够为中医活血化瘀药物治疗肿瘤提供实验依据。方法:以三棱-莪术配伍为研究对象,结肠癌为疾病对象,运用网络药理学的方法探索三棱-莪术配伍的主要活性成分,治疗结肠癌潜在作用靶点以及药物在疾病过程中发挥的生物学效应。体外实验将HUVEC细胞实验分为空白组、HUVEC 50组和HUVEC 150组,HCT116细胞实验分为空白组、HCT116 20组和HCT116 50组,结肠癌细胞共培养组实验分为Co-culture空白组、Co-culture 20组、Co-culture50组、Co-culture 150组。通过CCK-8、Ed U细胞增殖染色实验q PCR法、WB法检测药物对HUVEC细胞、HCT116细胞及共培养HUVEC细胞的影响。体内实验部分探索并建立结肠癌裸鼠模型。裸鼠皮下接种1.5*10~6个细胞。成瘤后将20只裸鼠随机分为模型组,奥沙利铂组,莪术挥发油组,莪术挥发油-奥沙利铂联用组4组。隔两日记录体重及瘤体体积,处死后称取瘤体重量,免疫荧光法检测瘤体的血管密度（CD31）、钙粘蛋白阳性率（D31-VEcadherin）、周细胞覆盖率（CD31-PDGFR）。结果:莪术挥发油干预细胞时,正常HUVEC细胞对莪术挥发油耐受度较大IC50=950mg/l,疾病模型结肠癌细胞HCT116对莪术挥发油耐受度较小,IC50=678.5mg/l。选取不同干预浓度:HUVEC细胞为低浓度50mg/L,中浓度150mg/L;HCT116细胞为低浓度20mg/L,中浓度50mg/L;与空白组相比,莪术挥发油中浓度干预能显著减少HUVEC细胞的增殖;莪术挥发油低浓度和中浓度均能显著减少HCT116细胞的增殖,且这种抑制效果具有浓度依赖性;莪术挥发油中剂量能够减少单独培养的HUVEC细胞的VEGFa RNA的表达量。结肠癌共培养的HUVEC细胞,其细胞贴壁状况较差,触角伸长,形态较单独培养的HUVEC细胞异常。疾病模型共培养的HUVEC细胞VEGFa表达量显著高于单独培养的HUVEC细胞。莪术挥发油（50mg/L与150mg/L）的干预能够在一定程度上逆转VEGFa RNA表达急剧升高的现象;在单独培养的HUVEC细胞中,莪术挥发油（50mg/L与150mg/L）处理能够显著降低HUVEC细胞中VEGFa蛋白的表达量。在共培养体系中莪术挥发油（50mg/L与150mg/L）处理也能够显著降低共培养HUVEC细胞中VEGFa蛋白的表达量,同时这种抑制作用具有浓度依赖性。体内实验裸鼠皮下接种了不同浓度的HCT116细胞,在观察期20天内,中浓度组细胞接种量接种裸鼠的肿瘤生长速度相对缓慢,大小相对均一。选择1.5*10~6个细胞作为实验使用的接种量。根据裸鼠体重倍数变化结果,皮下肿瘤种植后15天内,裸鼠体重均呈现上升趋势,第15天后各组体重均呈下降趋势,变化趋势没有组间差异。与模型组相比较,莪术挥发油组和莪术挥发油-奥沙利铂联用组肿瘤体积增长明显变慢;在模型组中微血管生成数量较多。莪术挥发油组,莪术挥发油-奥沙利铂联用组,奥沙利铂组的肿瘤微血管生成数量均有不同程度的减少,以莪术挥发油-奥沙利铂联用组减少最为明显;模型组肿瘤血管的周细胞覆盖率较低。而莪术挥发油组,莪术挥发油-奥沙利铂联用组,奥沙利铂组的肿瘤血管周细胞覆盖率均有不同程度的增加,其中以莪术挥发油-奥沙利铂联用组内周细胞覆盖率提升最为显著;模型组肿瘤血管的钙粘蛋白覆盖率较低。而莪术挥发油组,莪术挥发油-奥沙利铂联用组,奥沙利铂组的肿瘤血管钙粘蛋白覆盖率均有不同程度的增加。结论:莪术挥发油对HUVEC细胞和HCT116细胞的增殖具有一定的抑制作用,抑制作用随着浓度的增加而增强;莪术挥发油能够抑制HUVEC细胞VEGFa RNA的合成和蛋白的表达,也能够一定程度上逆转病理状态下的共培养体系中HUVEC细胞VEGFa m RNA的过度合成和蛋白的过度表达;莪术挥发油和奥沙利铂联用能够抑制肿瘤生长,减少肿瘤血管生成,促进血管钙粘蛋白的表达,增加内皮周细胞的覆盖率,在结构上使肿瘤血管正常化。
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