研究背景骨质疏松是一种以低骨量和骨组织微结构破坏为特征的代谢性骨骼疾病,导致骨折风险增加。骨重建是维持骨代谢平衡的重要过程,受破骨细胞的骨吸收和成骨细胞的骨形成两方面因素的调节。在骨质疏松的发生发展过程中,成骨细胞内发生内质网应激诱导的细胞凋亡。轻度内质网应激引起未折叠蛋白反应,调控细胞稳态,而时间过长或应激过强则引起细胞凋亡,最终导致疾病的发生。而且,内质网应激还可以激活细胞自噬,使细胞去除未折叠或错误折叠蛋白质和细胞器。当内质网应激持续时,未折叠蛋白反应并不足以维持细胞稳态,细胞自噬被激活。双链RNA依赖的蛋白激酶样激酶(PERK)是内质网应激的传感器,可刺激真核翻译起始因子2α(eIF2α)磷酸化并升高活化转录因子4(ATF4)水平,而p-eIF2α去磷酸化需要丝氨酸/苏氨酸磷酸酶PP1复合体的参与。ATF4一方面可以诱导自噬,另一方面可以诱导促凋亡因子CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)的表达。Salubrinal是一种人工合成的小分子化合物,可以抑制PP1复合体,选择性阻断p-eIF2α的去磷酸化,其有可能是治疗内质网应激相关疾病的策略。然而,salubrinal是否能通过调控eIF2α信号通路调节细胞内质网应激和自噬轴治疗骨质疏松的机制尚需阐明。研究目的为了研究salubrinal通过调控eIF2α信号通路治疗骨质疏松的机制,本实验采用鼠尾悬吊骨丢失模型检测了内质网应激在骨质疏松症发生发展中发挥重要作用。为了进一步明确机制,本研究将salubrinal作为一个调控内质网应激信号通路的工具,探讨调控内质网应激对骨丢失的改善作用。此外,采用卵巢去势的小鼠模型,探讨了salubrinal对绝经后骨质疏松症发病机制的影响,对骨髓间充质干细胞分化的作用,和通过调控eIF2α对成骨细胞内质网应激-自噬轴以及对破骨细胞活化T细胞核因子1(NFATc1)和Rac1的调控机制。研究方法实验一:首先,采用54只C57BL/6(~16周龄,20 g)雌性小鼠来评估内质网应激在失重诱导的骨质疏松症发展中的作用。将这些小鼠分成9组:年龄匹配对照组(AC)和8个鼠尾悬吊组(HU,按悬吊时间分组:3 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、7 d和14 d;每组实验动物数均n=6)。不同时间点取材,进行组织学和骨髓细胞实验,检测鼠尾悬吊对成骨细胞分化和破骨细胞发育的影响。蛋白质免疫印记分析不同时间点内质网应激相关蛋白的表达。相关性分析验证内质网应激与成骨细胞分化和破骨细胞发育的相关性。其次,将81只小鼠随机分成三组(n=27):年龄匹配的对照组(AC)、鼠尾悬吊组(HU)和皮下注射salubrinal治疗的鼠尾悬吊组(US),治疗2周。扫描骨矿密度(BMD)和骨显微结构,使用苏木素-伊红(H&E)染色分析骨量变化。组织学和骨髓细胞实验检测salubrinal对成骨细胞分化和破骨细胞发育的影响。使用透射电子显微镜、免疫组化、末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)染色和蛋白质印记分析(Western blot)等方法分析salubrinal调控内质网应激减少骨丢失的作用机制。实验二:将123只C57BL/6(~16周龄,20 g)雌性小鼠随机分为3组:假手术组、卵巢去势(OVX)组和皮下注射salubrinal治疗的卵巢去势组(n=41)。造模4周治疗4周,进行透射电子显微镜、Western blot,免疫荧光分析,以评估salubrinal对成骨细胞内质网应激和自噬的改变。采用MC3T3-E1和RAW264.7细胞系和骨髓原代细胞检测salubrinal对成骨细胞和破骨细胞的作用机制。分离股骨标本进行骨密度扫描和骨显微结构及组织学分析,以检测salubrinal改善OVX诱导的骨丢失的作用。研究结果:结果表明,在鼠尾悬吊骨丢失模型中,骨小梁面积分数(B.Ar/T.Ar)以及成骨细胞的数量呈时间依赖性显著减少,而破骨细胞数量显著增加。Bip、p-eIF2α和ATF4的表达在悬吊6 h内(短期内)显著增加,但在HU 2 d到HU 14 d内呈时间依赖性降低。相关性分析表明内质网应激与成骨细胞和破骨细胞分化显著相关。Salubrinal治疗显著抑制了骨质疏松导致的BMD和B.Ar/T.Ar降低,以及破骨细胞的形成、迁移和黏附。同时,salubrinal显著增加了成骨细胞集落形成单位和成纤维细胞集落形成单位。Salubrinal通过调控成骨细胞内质网应激相关蛋白Bip、p-eIF2α和ATF4的表达减少骨丢失,改善粗面内质网扩张。在成骨细胞中,TUNEL染色与CHOP表达都表明salubrinal可以改善内质网应激诱导的凋亡。总的来说,salubrinal通过调控eIF2α信号传导抑制了鼠尾悬吊引起的骨丢失。在卵巢去势模型中,salubrinal调控成骨细胞内质网应激和自噬的激活,通过eIF2α信号通路调控LC3和p62的表达促进成骨细胞分化,上调Atg7的表达促进成骨细胞的自噬。Salubrinal促进外成骨细胞的分化及矿化,并抑制破骨细胞系NFATc1的表达和Rac1 GTP酶活性。通过siRNA部分沉默Rac1表明salubrinal抑制TRAP和组织蛋白酶K的mRNA水平。Salubrinal显著抑制破骨细胞形成、迁移和粘附功能,同时抑制破骨细胞的发育。BMD、显微计算机断层扫描(μCT)、H&E染色及钙黄绿素实验表明,salubrinal显著改善OVX诱导的骨密度和骨体积分数的减少。总之,我们的结果证明salubrinal通过调控eIF2α信号通路改善骨质疏松症的作用。结论本研究通过使用两种骨质疏松小鼠模型,证明:1)内质网应激在骨质疏松症的发展中发挥重要作用;2)Salubrinal通过调控骨髓细胞的分化显著改善鼠尾悬吊和卵巢去势引起的骨丢失;3)Salubrinal通过调控eIF2α介导的的内质网应激-自噬轴促进成骨细胞的骨形成;4)Salubrinal通过调控NFATc1和Rac1的表达抑制破骨细胞的骨吸收。