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目的:机体通过吞噬作用清除凋亡细胞(apoptotic cell,apo),避免凋亡细胞的具有潜在细胞毒性、免疫原性或致炎性的坏死成分暴露在周围环境中引发自身免疫反应和炎症反应,这是机体一种重要的防御功能。因此快速有效清除体内的凋亡细胞对人体正常生长发育和维持内环境稳定起着至关重要的作用,凋亡细胞主要由专职吞噬细胞如巨噬细胞、未成熟的树突状细胞等吞噬清除,部分被非专职吞噬细胞如成纤维细胞、上皮细胞等吞噬。机体控制炎症不单单是通过快速有效的清除凋亡细胞,还包括调控炎症性细胞因子产生。近年来又有很多实验证明细胞因子表达水平的变化与很多疾病相关,比如,白细胞介素-23(IL-23)高表达与类风湿性关节炎(RA)、银屑病等自身免疫病和肿瘤等疾病相关,IL-12又对黑色素瘤、肠腺癌、肝癌[7]等肿瘤有抑癌作用。还有大量实验发现凋亡细胞被巨噬细胞等抗原提呈细胞吞噬过程中会调控其细胞因子表达水平,比如正向调节IL-10和负向调节IL-12等。IL-12家族中IL-12和IL-23不仅结构上都是由两个亚基(IL-12p35、IL-12p40和IL-23p19、IL-23p40)组成的异源二聚体结构,有共同的亚基p40,而且它们都可由激活的抗原提呈细胞产生。对于IL-12和IL-23与疾病的相关性已经有很多实验报道,对于其作用机制也有了很多了解,本实验由此着手,研究凋亡细胞对巨噬细胞受刺激表达IL-12家族细胞因子的调控方向和调控机制,重点研究IL-23细胞因子,为明确相关疾病的发生发展和细胞因子临床应用奠定分子学基础。方法:1 Jurkat细胞(人外周白血病T细胞)的复苏、培养及凋亡细胞的制备,流式细胞技术检测细胞凋亡情况。2小鼠腹腔巨噬细胞的提取、培养。3 RAW264.7细胞和小鼠腹腔巨噬细胞分别用空白、凋亡细胞(apotosis cell)、脂多糖(LPS)和凋亡细胞+LPS刺激。实时定量PCR(Real-time PCR)检测各组m IL-12p35、m IL-12p40、m IL-23p19水平。4用ELISA方法检测各组活化RAW细胞培养液IL-10、前列腺素2(PGE2)和转化生长因子-β(TGF-β)的量。5针对IL-23p19 RNA设计随机引物,对各组刺激后RAW细胞做Real-time PCR检测IL-23p19转录前水平。6用含IL-23p19基因启动子的质粒转染RAW细胞,培养48小时后裂解检测各组荧光素蛋白强度。7对RAW细胞分别用凋亡细胞、凋亡细胞+LPS刺激,刺激后加入转录抑制剂dichlorobenzimidazole(DRB)+放线菌素D(ACD),阻止新的RNA产生,检测两组各时间点p19m RNA衰变情况。8用Western Blot(免疫印迹实验)检测被刺激RAW细胞中总p38和磷酸化p38的含量。9用不同浓度的MAPK p38信号转导通路阻断剂SB203580作用RAW细胞后用LPS刺激,Real-time PCR检测各组p19m RNA水平。10设计质粒转染RAW264.7细胞使其高表达p38,再分别用空白、apo、LPS刺激细胞,通过Real-time PCR检测各组p19m RNA水平。11将apo+LPS刺激后的RAW细胞分两组,其中一组加入SB203580,Real-time PCR检测各时间点两组p19m RNA水平。结果:1用星形孢菌素(staurosporine)处理Jurket细胞成功制备凋亡细胞,提供后续研究的刺激条件。2凋亡细胞(apo)+LPS作用于腹腔巨噬细胞产生的IL-12p35、IL-12p40、IL-23p19m RNA量较单独用LPS刺激减低。凋亡细胞(apo)+LPS作用于RAW巨噬细胞产生的IL-12p35、IL-12p40、IL-23p19m RNA量较单独用LPS刺激减低。差异具有统计学意义。所以凋亡细胞对LPS诱导巨噬细胞表达的IL-12p35、IL-12p40、IL-23p19m RNA均有抑制作用。3用ELISA方法检测各组活化后RAW264.7细胞株和小鼠腹腔巨噬细胞分泌IL-10、PGE2、TGF-β的量,发现凋亡细胞对IL-10、PGE2的分泌无影响,但是促进TGF-β的分泌,差异具有统计学意义。4利用real-time PCR检测分别用空白对照、凋亡细胞(apo)、LPS和凋亡细胞(apo)+LPS刺激的RAW细胞的m IL-23p19水平,发现凋亡细胞并没有在转录水平上抑制IL-23p19的表达,所以凋亡细胞对m IL-23p19的抑制作用不是在转录水平实现的。5用含有m IL-23p19启动子的质粒转染RAW细胞后,培养裂解细胞检测荧光素蛋白含量,发现凋亡细胞(apo)+LPS刺激的RAW细胞的荧光素蛋白最高,说明凋亡细胞不会抑制IL-23p19的启动子的作用,进一步验证凋亡细胞对m IL-23p19的抑制作用不是在转录水平实现的。6激活的RAW细胞加入转录抑制剂放线菌素D和dichlorobenzimidazole(DRB)检测IL-23p19 m RNA剩余量,发现单单LPS刺激RAW细胞产生IL-23p19 m RNA的衰变速度慢于凋亡细胞(apo)+LPS共同刺激时。说明凋亡细胞抑制IL-23p19表达可能是通过促进IL-23p19 m RNA衰变实现的,凋亡细胞的抑制作用是在转录后水平实现的。7通过Western Blot发现凋亡细胞(apo)+LPS刺激后的RAW细胞的磷酸化的p38含量明显少于LPS刺激后的RAW细胞,说明凋亡细胞抑制了p38的磷酸化,进而抑制了MAPK p38信号传导通路。8 RAW细胞加入不同浓度的MAPK p38信号转导通路阻断剂SB203580,再用LPS刺激,发现IL-23p19 m RNA水平与SB203580浓度呈反比,说明MAPK p38信号转导通路对巨噬细胞表达IL-23p19很重要。9与转染空白质粒的RAW细胞相比,转染后高表达p38的RAW细胞在被LPS刺激后IL-23p19 m RNA水平明显增高,进一步说明MAPK p38信号转导通路对巨噬细胞表达IL-23p19很重要。10用apo+LPS活化的RAW细胞加入SB203580组较未加组的p19 m RNA衰变的快。结论1凋亡细胞抑制活化巨噬细胞IL-12p35、IL-12p40、IL-23p19 m RNA的表达。2凋亡细胞对IL-10和PGE2分泌无影响,但促进TGF-β的分泌。3凋亡细胞对m IL-23p19的抑制作用不是在转录水平实现的,而是通过加速p19m RNA衰变实现的。4凋亡细胞通过抑制p38磷酸化阻断p38 MAPK信号传导通路实现对IL-23p19表达的抑制作用。