干旱胁迫下太行菊类黄酮含量变化及相关基因的表达分析

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菊花(Chrysanthemum morifolium)是中国的传统名花,观赏价值极高。当前,全球范围内的水资源匮乏,严重制约了农作物的生产,也对菊花产业的发展造成了较大的阻碍。太行菊(Opisthopappus taihangensis)是菊花抗旱育种研究的一个重要种质资源,且含有较多类黄酮物质,目前对于太行菊抗旱机制的研究较少。已有研究表明MYB转录因子在调控类黄酮合成以及植物抗旱中发挥重要作用,类黄酮以及MYB转录因子在太行菊响应干旱胁迫中的功能尚未见报道。鉴于此,本研究首先对太行菊进行干旱胁迫处理,测定类黄酮含量及其合成关键酶基因变化;对筛选的3个OtMYB转录因子进行克隆、表达模式分析、亚细胞定位以及功能预测;同时进行了干旱胁迫下s RNA和降解组测序,对太行菊抗旱分子机理进行了初步探究。主要研究结果如下:(1)对太行菊和菊花脑(Chrysanthemum nankingense)进行20%PEG6000模拟干旱和复水处理,结果表明太行菊萎蔫速度较慢,复水后稍有恢复;而菊花脑失水速度大于太行菊,且复水后无恢复。测定两者根和叶的总黄酮和5种类黄酮的含量,太行菊叶片和根系中黄酮类物质的含量随着胁迫时间的延长而上升,24h达到最高,复水后稍有降低;菊花脑叶片黄酮含量叶随干旱时间延长而增加,但复水后继续含量持续增加。对太行菊叶片和根系中类黄酮合成相关结构基因的表达量分析,所选择的6个基因Ot4CL、Ot LAR、Ot FLS、Ot ANR、Ot ANS、Ot DFR均受到干旱胁迫的诱导出现不同程度的上调表达。推测类黄酮及其合成相关功能基因可能参与太行菊的干旱应答。(2)采用RT-PCR方法克隆3个OtMYB转录因子。OtMYB4、OtMYB12、OtMYB44的ORF长分别为819 bp、792 bp和1020 bp,编码272、263、339个氨基酸。3个OtMYB蛋白均在N端含有保守的R2R3-MYB结构域,系统进化树分析表明OtMYB4属于MYB家族中R2R3-MYB转录因子的第4亚族,OtMYB12属于第7亚族,OtMYB44属于第22亚族。构建OtMYBs蛋白与GFP的融合表达载体和过表达载体。注射本氏烟草叶片亚细胞定位结果表明,3个OtMYB蛋白均定位于细胞核。(3)干旱处理下太行菊叶片和根系中OtMYB4、OtMYB12、OtMYB44的表达模式分析显示,干旱下两个部位OtMYB4、OtMYB12表达模式呈现一定波动性,但整体上调表达,复水后稍降低。OtMYB44在干旱处理期间出现先下调后上调,复水后表达量上升,推断这3个OtMYB转录因子在响应干旱中发挥调控作用。(4)sRNA测序共鉴定出791个miRNAs,包括已知514个miRNAs和297个新miRNAs,其长度分布主要集中在21-24 nt,属于140个miRNA家族。差异表达基因筛选发现,在DR vs.CR、DL vs.CL、DR vs.DL文库间,分别由有49、50、67个极显著差异表达的miRNAs。降解组测序共获得1703个靶基因,其中42个已知的miRNAs靶向1591个m RNAs,6个新的miRNAs靶向112个m RNAs。GO富集分析表明,转录因子活性、ABA激活的信号转导等富集到较多的靶基因。联合miRNA、转录组和降解组分析显示,miRNA主要通过植物激素信号转导通路响应胁迫,其中数量最多的靶基因为转录因子主要包括MYB、NAC、ERF/AP2等,分别被mi R858、mi R164、mi R172靶向。综上所述,本文研究了干旱胁迫下太行菊类黄酮含量及其合成功能基因的变化规律,对筛选到的OtMYB4、OtMYB12、OtMYB44转录因子进行基因克隆、生物信息学分析和功能验证,推测其在太行菊应答干旱胁迫和类黄酮合成中发挥作用。通过s RNA和降解组测序鉴定出众多抗旱相关的miRNA和靶基因,联合分析发现mi R858a可能靶向调控OtMYB4和OtMYB12。本研究可为进一步探究太行菊的抗旱分子机理奠定基础。
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