论文部分内容阅读
目的:探讨阻断Kupffer细胞(KCs)TIM-4对诱导小鼠原位肝移植术后调节性T细胞(i Treg)的产生以及相关机制的研究。方法:1.小鼠原位肝移植术后KCs TIM-4的表达以及阻断TIM-4对肝移植急性排斥反应的影响采用改良的Kamada“二袖套管”法建立C57BL/6→C3H小鼠原位肝移植急性排斥反应模型。在未处理小鼠中,小鼠仅做原位肝移植而未做任何处理(LT组),设sham为对照组(仅开腹手术暴露门静脉)。免疫组化检测LT组和sham组移植术后1d、2d、3d受体肝组织中KCs的活化情况。分离受体KCs,Western blot和RT-PCR检测移植术后1d、3d、7d KCs TIM-4蛋白以及m RNA表达情况。在处理小鼠中,实验动物随机分为3组:sham组,小鼠开腹手术暴露门静脉,并经门静脉注入1m L PBS;control m Ab组,于供体冷血TIM-4 m Ab组,于供体冷血期经门静脉注入含抗TIM-4抗体(0.35mg/只)的1m L PBS。各组均于术后3d经尾静脉再次分别注入上述液体。小鼠于移植后7d麻醉下开腹穿刺取腹主动脉血0.5m L,然后处死小鼠,取下中叶肝组织,余固定包埋。提取各组肝脏KCs,激光共聚焦检测KCs TIM-4阻断情况;全自动生化分析仪检测各组小鼠血清AST、ALT、TBIL;ELISA和Western blot检测各组小鼠肝组织匀浆TNF-α、IFN-γ、CCL2、CXCL2表达水平;TUNEL法检测各组肝组织细胞凋亡情况;Western blot检测各组KCs p-P65和p-P38蛋白表达水平。2.阻断KCs TIM-4对初始CD4+T细胞分化以及IL-4/STAT6信号通路的影响分离模型LT组KCs,流氏分选出TIM-4+KCs(预先加或不加0.5mg/L TIM-4 m Ab处理)。分离和纯化WT C3H小鼠脾脏初始CD4+T细胞。将上述两种细胞按1:1比例进行共培养3d。处理分为三组:control组,作为对照组,不予以处理;control m Ab组,预先加入0.5mg/L control m Ab处理;TIM-4 m Ab组,预先加入0.5mg/L TIM-4 m Ab处理。收集各组T细胞以及上清液。CFSE法检测各组CD4+T细胞增殖情况;ELISA检测各组上清IL-4、IL-6、IL-13表达水平;流氏细胞术检测各组CD4+CD25+Foxp3+T细胞的产生情况。分离模型LT组KCs,流氏分选出TIM-4+和TIM-4-KCs,并按1:1比例与初始CD4+T细胞共培养3d,分为三组:control组,作为对照组,仅初始CD4+T细胞单独培养;TIM-4+组,TIM-4+KCs与CD4+T细胞共培养组;TIM-4-组,TIM-4-KCs与CD4+T细胞共培养组。Western blot分析T细胞p-STAT6蛋白表达情况;上述各组用0.5mg/L TIM-4m Ab+/-处理,Western blot分析T细胞p-STAT6蛋白表达情况;在TIM-4+组中,用0.5mg/L TIM-4 m Ab+/-和IL-4+/-处理,Western blot分析T细胞p-STAT6蛋白表达情况。3.阻断TIM-4+KCs TIM-4功能诱导的i Treg对肝移植排斥反应以及小鼠生存率的影响分离模型LT组KCs,流氏分选出TIM-4+KCs(预先用TIM-4 m Ab处理)与初始CD4+T细胞进行共培养,3d后获取CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞,调整i Treg细胞浓度1×106个/m L,将所得细胞于供体冷血期经门静脉注入i Treg组,sham组以及LT组注入相应的PBS作为对照。部分小鼠于移植后7d麻醉下开腹穿刺取腹主动脉血0.5m L,然后处死小鼠,取下中叶肝组织,余固定包埋。全自动生化分析仪检测各组小鼠血清AST、ALT、TBIL;HE检测各组小鼠肝组织病理变化情况;余下各组小鼠作为观察生存期之用,观察期以小鼠死亡为终点,并做Log-Rank生存资料分析。结果:1.(1)小鼠移植术后肝组织KCs的活化数随着时间变化逐渐增多。术后1d、3d、7d KCs TIM-4蛋白相对表达水平分别为0.31±0.04、0.86±0.05、0.77±0.03,明显高于sham组的0.11±0.03(P<0.05),m RNA相对表达水平分别1.96±0.07、5.25±0.23、4.02±0.17,显著高于sham组的0.98±0.03(P<0.05)。(2)在处理小鼠分组中,激光共聚焦检测KCs TIM-4表达情况发现,TIM-4 m Ab组TIM-4荧光表达强度明显低于control m Ab组(P<0.05)。术后7d,与sham组比较,control m Ab组血清肝功AST、ALT、TBIL以及肝组织匀浆炎症因子TNF-α、IFN-γ、CCL2、CXCL2水平明显增高(P<0.05),而TIM-4 m Ab组上述指标水平明显低于control m Ab组(P<0.05)。Western blot检测肝脏组织炎症因子蛋白表达和上述结果一致。各组肝组织细胞凋亡指数(AI),TIM-4 m Ab组AI值(11.04±2.28)明显低于TIM-4 m Ab组(29.23±2.56)(P<0.05)。TIM-4 m Ab组p-P65以及p-P38蛋白表达水平分别为0.82±0.23、0.54±0.10,明显低于control m Ab组的1.39±0.27、1.07±0.23(P<0.05)。2.(1)KCs与CD4+T细胞按共培养发现,control、control m Ab以及TIM-4 m Ab组CD4+T细胞的增殖率分别为(32.3±1.2)%、(31.1±1.4)%、(16.9±0.5)%。ELISA检测各组上清IL-4、IL-6、IL-13分泌水平发现,阻断TIM-4+KCs TIM-4可明显减少上述炎症因子的分泌(P<0.05)。流式检测各组CD4+CD25+Foxp3+T细胞产生情况,control组、control m Ab组以及TIM-4 m Ab组CD25、Foxp3双阳性细胞分别为(12.8±0.3)%、(13.3±0.5)%、(28.1±0.4)%,后者明显高于前两组(P<0.05)。(2)TIM-4+组T细胞p-STAT6相对蛋白表达水平(1.75±0.06)明显高于TIM-4-组(0.60±0.06)(P<0.05)。然而TIM-4+KCs与CD4+T细胞共培养时,加入或未加入TIM-4 m Ab的p-STAT6蛋白表达分别为2.29±0.25、1.30±0.11,两者比较差异有统计学意义(P<0.05),此现象在TIM-4-组间比较无统计学上的差异(P>0.05)。另外,向培养液中加入IL-4(0.25mg/L)发现,阻断KCs TIM-4的表达,外源性加入IL-4可明显增高CD4+T细胞p-STAT6蛋白的表达(P<0.05)。3.(1)LT组肝功指标明显高于sham组,差异具有统计学意义(P<0.05),而i Treg组肝功指标明显好转(P<0.05)。肝组织病理学检查,i Treg组RAI平均得分为3.97±0.67,明显低于LT组8.47±0.90(P<0.05)。(2)i Treg组小鼠平均存活时间(55.7±5.5)d明显长于LT组平均存活时间(14.5±3.7)d(P<0.05)。结论:1.小鼠移植术后,活化的KCs TIM-4的表达水平逐渐增高。阻断KCs TIM-4可能通过影响NF-κB以及MAPK通路减少炎症因子的释放,改善肝组织排斥反应的损伤。2.阻断KCs TIM-4通过抑制IL-4/STAT6信号通路促进初始CD4+T细胞向i Treg细胞的分化。3阻断TIM-4+KCs TIM-4功能诱导的i Treg细胞可明显改善急性排斥反应损伤以及提高小鼠生存率。