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NLRC5是新近发现的天然免疫受体NOD样受体家族成员之一,目前在人和小鼠的多种细胞类型中,已证实其对I型干扰素产生通路具有显著的调控作用,同时能够调节经典与非经典MHC I类分子基因的转录及表达及在炎症小体的形成过程中也起到了关键作用,在抗病原微生物天然免疫中扮演重要角色。黏膜免疫在机体免疫中有着非常重要的作用,但目前,关于NLRC5在肠上皮细胞及肠黏膜局部天然免疫中的作用尚不清楚。本研究拟构建NLRC5基因敲低的猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)模型,以猪萨佩罗病毒作为模式病毒,探讨NLRC5在肠黏膜天然免疫中的功能及相关机制。本研究的实验方法及结果如下:1、成功构建NLRC5基因敲低的IPEC-J2细胞模型,基因表达下调率达到94%,为后续实验提供了可靠的基础。2、分别在NLRC5基因敲低细胞模型及转染scramble序列载体的对照细胞组上感染接种猪萨佩罗病毒(MOI=1),选取6h、12h、以及24h三个感染时间点作为研究对象,每组每个时间点设置3个平行重复。然后分别在这三个时间点收集细胞,提取RNA。3、利用RNA-Seq技术对RNA样本进行转录组测序,筛选出实验组与对照组差异表达基因,同时对差异表达基因进行荧光定量PCR验证,最后对这些基因进行GO及KEGG分析。NLRC5基因敲低的实验组与转染空载体的对照组在猪萨佩罗病毒感染后6h、12h、24h的三个时间点RNA样本进行转录组测序,并筛选差异表达基因。结果显示,6h共获得61个差异表达基因,其中41个表现为下调,20个表现为上调;12h筛选出117个差异基因,其中85个基因表现为下调,32个基因表现为上调;24h筛选出22个基因,其中17个基因表现为下调,5个基因表现为上调。荧光定量PCR结果与转录组测序结果基本一致,证明高通量测序数据可靠,具有可信性。差异表达基因的GO及KEGG分析显示,6h差异表达基因GO分析涉及生物学过程、细胞组分及分子功能3个大类32个小类,较为富集的类别有生物行为、生物附着、细胞及绑定类别,该时间点差异表达基因KEGG分析显示共涉及80个通路,较为富集的是丙型肝炎通路、单纯疱疹感染通路、RIG-I样受体信号通路通路及泛素介导的蛋白水解作用通路。12h差异表达基因GO分析共涉及38个小类,较为富集的类别有生物附着、细胞及催化活性类别,该时间点差异表达基因KEGG分析显示共涉及139个通路,较为富集的为细胞因子受体相互作用通路、甲型流感通路、丙型肝炎通路、类风湿性关节炎通路、NOD样受体信号通路及肠道免疫网络IgA的生成通路。24h差异表达基因GO分析共涉及28个小类,较为富集的生物调节、细胞及绑定类别,24h差异表达基因KEGG分析显示共涉及29个通路,较为富集的为亨廷顿氏舞蹈病通路、单纯疱疹感染通路、细胞因子受体相互作用通路、RIG-I样受体信号通路。本研究通过对NLRC5基因敲低的IPEC-J2细胞模型及对照组感染猪萨佩罗病毒后的差异表达基因进行比较分析发现,关键基因主要分为三个类别,分别是干扰素相关基因、受体相关基因及炎症因子相关基因。进一步分析发现NLRC5对Ⅰ型干扰素及Ⅲ型干扰素及其相关基因的表达起到正向调控作用;NLRC5基因可影响RIG-I受体相关基因及其通路的表达;NLRC5对炎症因子的表达也呈正向调控,参与了机体的炎症反应。此外,肠道免疫网络IgA的生成通路在感染中期得到了显著富集且该通路所涉及的关键基因表达下调,说明NLRC5在肠黏膜免疫中发挥着重要的作用,但其具体调节机制有待进一步的研究。