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植酸酶和木聚糖酶是两种广泛使用的酶制剂,可应用到饲料、食品、造纸、环境治理等生产过程中。在上述产业中,植酸酶和木聚糖酶在饲料工业中的应用最为成熟,为饲料工业的可持续发展提供了高效、节粮、环保等保障。为了进一步降低生产成本并提高酶的应用性能,本研究结合计算模拟技术和定点突变技术,对两种酶制剂的酶学性质进行改造。首先,针对各个蛋白的空间结构或结构参数进行比较、分析,寻找可能改变其酶学性质的突变位点;随后,利用定点突变技术、构建表达载体、发酵突变蛋白、测定突变蛋白的酶学特性;最后,利用分子动力学模拟阐明其酶学性质改变机制。本研究对植酸酶和木聚糖酶分别进行如下改造:1.来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的植酸酶(phy-N)酶活高,但热稳定性较差;而烟曲霉(Aspergillus fumigatus)植酸酶(phy-F)热稳定性良好,但酶活相对较低。如果能够将二者优势叠加,将有利于植酸酶的应用和推广。(1)本研究首先将两种植酸酶phy-N和phy-F进行三维结构的超级叠加(superimpose),计算其相对应原子的距离,结果发现有三部分(Glu35-Ser42,Gly163-Arg168和Arg248-Ser254)氨基酸序列的距离偏差?4?。因此,首次对这三部分共18个氨基酸残基进行复合突变,获得突变型植酸酶phy-N-18,并对比野生型和突变型植酸酶的酶学特性:突变型植酸酶phy-N-18及野生型phy-N的最适温度均为50℃,高于55℃时酶活力迅速下降,均属于中温酶;phy-N-18的最适pH为6.0,较phy-N提高了0.5个单位,pH稳定性研究表明phy-N-18较phy-N具有更宽的作用范围;phy-N-18的热稳定性较phy-N有良好的改良,在高温环境下(70℃,80℃,90℃),分别对其进行长时间耐受,phy-N-18相对剩余活力高于phy-N:在70℃、80℃和90℃下处理两种植酸酶1小时,phy-N-18比phy-N的相对剩余活力提高了20.3%、19.8%和3.4%;此外,将phy-N-18与10种市场在售的植酸酶产品进行热稳定性比较,phy-N-18的热稳定性处于中等水平,但较phy-N已有大幅提升。我们获得了一株热稳定性有所改良的植酸酶phy-N-18,实验显示突变的18个位点能够提高植酸酶phy-N热稳定性。(2)实验证明植酸酶phy-N-18的热稳定性较野生型phy-N有所提高。然而,我们并不清楚具体哪些突变位点在18个突变位点中起主要作用。因此,利用分子动力学模拟技术对野生型和突变型植酸酶分别进行两个温度(50℃和70℃)的模拟分析,通过扫描18个位点在野生型和突变型植酸酶中与其它氨基酸的相互作用,我们发现在突变型植酸酶phy-N-18中有9个氨基酸与周围的氨基酸残基形成的氢键概率显著高于野生型中这9个位点氢键形成的概率。因此,我们将目光集中于这9个位点,将野生型植酸酶phy-N进行定点突变和克隆表达,获得突变型植酸酶phy-N-9,其酶学特性研究如下:植酸酶phy-N-9的温度适应性与phy-N及phy-N-18一致;其pH适应性与phy-N-18一致;phy-N-9的热稳定性较phy-N-18及phy-N有更高的提升,在70℃、80℃和90℃条件下处理1小时,phy-N-9的相对剩余酶活比phy-N-18分别提高14.1%、17.2%和25.9%,相比phy-N更是提高了34.4%、37.0%和29.3%;而phy-N-9相比10种市场在售的植酸酶产品,其热稳定性居于领先水平,明显好于phy-N-18;然而,突变型植酸酶phy-N-9和phy-N-18的催化效率相对野生型phy-N有所下降,分别下降60.0%和68.0%,此现象有待进一步的研究。2.来源于Neocallimastix patriciarum木聚糖酶Xyn CDBFV是一种市场上广泛应用的耐热木聚糖酶,然而面对木聚糖酶在工业生产中尤其是高温环节的需求,改造其酶学性质得到耐热性更强木聚糖酶仍是一项艰巨的任务。已知,来自Nonomuraea flexuosa耐热木聚糖酶NFX具有极高耐热性。因此,我们通过比对XynCDBFV和NFX晶体结构中的温度因子(B-factor)参数,发现相比于NFX,XynCDBFV的C端序列(207-NGGA-210)极不稳定。通过多序列比对,我们首次发现不论是细菌来源的还是真菌来源的木聚糖酶在C端有一段保守的序列(207-SSGS-210),因此我们将XynCDBFV的207-NGGA-210氨基酸利用定点突变技术突变为207-SSGS-210(N207S,G208S,A210S)一个带有三个突变位点的突变型木聚糖酶Xyn-MUT,并构建真核表达载体,对其发酵、纯化并研究野生型与突变型木聚糖酶酶学特性,如下:热稳定性研究表明,在70℃、80℃和90℃条件下处理木聚糖酶1小时,Xyn-MUT的相对剩余酶活比XynCDBFV分别提高了5.8%、14.2%和7.5%;动力学研究显示:Xyn-MUT的催化效率较XynCDBFV提高了0.6倍。突变型木聚糖酶Xyn-MUT相比XynCDBFV的耐热性有显著提高,为了在分子层面阐述其耐热机理,我们在65℃和80℃分别对二者进行分子动力学模拟,模拟分析发现:Xyn-MUT中的S210和S208相比与XynCDBFV中的A210和G208能够形成更多的氢键;同时Xyn-MUT中207-SSGS-210形成β折叠的倾向性更高。本研究为第一例通过改造木聚糖酶的C端序列来提高其热稳定性的研究,为今后木聚糖酶的改造提供了新思路。综上,利用计算机辅助设计和定点突变技术,我们获得了一株较野生型热稳定提高约30.0%、pH适应范围更广的突变型植酸酶phy-N-9和一株较野生型热稳定性提高约10.0%、催化效率提高0.6倍的突变型木聚糖酶Xyn-MUT,这两株突变酶能够更好地应用到饲料工业及其他相关产业。