论文部分内容阅读
目的：为了克服恶性血液病多药耐药(MDR)和增加药物的靶向性,我们研制一种既能阻止药物外排又有特异性磁靶向定位的新型化疗药物——共载化疗药物柔红霉素(DNR)和耐药逆转剂5-溴汉防己甲素(Br Tet)的磁性纳米Fe3O4颗粒(MNPs)(DNR／Br Tet-MNPs)。
方法：通过化学共沉淀法制备纳米级Fe3O4颗粒,采用油酸及两亲三段式高分子聚合物Pluronic F127对其进行表面修饰,制备空白MNPs载体。单载柔红霉素的磁性纳米Fe3O4颗粒(DNR—MNPs)为先行试验基础,摸索出最佳合成工艺,进一步制备DNR／Br Tet-MNPs。通过高分辩透射电镜、X线衍射分析仪、傅立叶变换红外光谱仪、马尔文粒径仪、高效液相色谱仪、紫外分光光度计、体外透析试验及振动磁强计等对制备的空白载体或载药纳米颗粒进行物理表征,采用药物抑制试验评估空白载体的安全性以及载药纳米颗粒在体外对人白血病敏感细胞株K562细胞和耐药细胞株K562／A02细胞的抑制作用,流式细胞技术检测细胞凋亡率和细胞内DNR的累积量、RT-PCR和Western blotting分析mdrl／P-gp表达以及凋亡相关基因转录和蛋白表达,流式细胞术检测细胞内罗丹明123含量以评估P-gp的功能。
结果：1、制备的MNPs主要为Fe3O4,呈规则球形,直径10～20nm；在油酸及Pluronic修饰前后Fe3O4晶体衍射峰的位置及强度均没有改变；Pluronic F127成功修饰了油酸包裹的Fe3O4颗粒；DNR—MNPs和DNR／Br Tet-MNPs的平均水合半径分别为94 nm和135 nm,Zeta电位分别为-21.31±0.43 mV和-27.02±0.75 mV；DNR—MNPs和DNR／Br Tet—MNPs的载药量分别为7.62％和8.25％；DNR—MNPs体外释放实验显示,药物释放呈双相性模式,在最初的5天存在突释现象,释放出42％的DNR(其中20％的DNR在前2天释放)此后呈现良好的缓释特征,释放曲线的趋势平缓,释放时间较长,持续25天可累积释放达69％。DNR／Br Tet-MNPs的体外释放同样呈双相性模式,最初5天分别释放48％的DNR和37％的Br Tet(其中前2天分别有19％的DNR和16％的Br Tet释放),25天可累积释放76％的DNR和63％的Br Tet。DNR-MNPs和DNR／Br Tet-MNPs都具有良好的超顺磁性。
2、对于敏感株K562细胞,无论DNR-MNPs或是裸药(DNR—Sol)的抑制作用均随着浓度的增加而增强,DNR-MNPs的IC50值(2.28±0.63μg／mL)高于DNR—Sol(0.86±0.02μg／mL)(P<0.05)。DNR—MNPs和DNR-Sol对K562细胞的凋亡率分别为35.27±5.27％和50.07±7.39％,显著高于对照组(P<0.05)。DNR—MNPs和DNR—Sol处理K562细胞后,细胞内DNR显著增多,相对荧光强度(RFI)分别为为10.79±1.59和10.78±2.53,二组之间没有统计学差异。DNR-MNPs组大部分细胞DNR分布于胞浆,少数细胞有胞核分布,而DNR-Sol组胞浆胞核均可见DNR分布,少数细胞仅见胞浆分布；二组细胞均可见到核固缩、核碎裂、核溶解等细胞凋亡的特征性改变。
3、对于耐药株K562／A02细胞,无论DNR／Br Tet-MNPs或是裸药(DNR／BrTet-Sol)的抑制作用亦均随着浓度的增加而增强,DNR／Br Tet-MNPs的IC50值(8.404±1.26μg／mL)高于DNR／Br Tet-Sol(1.01±0.17μg／mL)。DNR／BrTet-MNPs和DNR／Br Tet-Sol均能显著增加K562／A02细胞内DNR浓度,DNR／BrTet-MNPs组RFI(25.97±2.28)显著高于DNR／Br Tet-Sol组(16.75±1.47)。DNR／BrTet-MNPs组中可见到DNR主要分布在胞浆和胞核内,而DNR／Br Tet-Sol组可以观察到细胞核内DNR的含量显著增加,二组细胞亦均可见到细胞凋亡的特征性改变。DNR／Br Tet-MNPs和DNR／Br Tet-Sol均能显著增加K562／A02细胞凋亡率,分别为24.60±4.42％和44.02±9.09％。DNR／Br Tet-MNPs和DNR／Br Tet-Sol均能下调K562／A02细胞mdrl／P-gp表达,并部分抑制P-gp功能,与DNR／Br Tet-Sol相比,DNR／Br Tet-MNPs的作用稍弱。DNR／Br Tet-MNPs和DNR／Br Tet-Sol均能上调K562／A02细胞bax／bcl-2比值和caspase3基因转录和蛋白表达,下调survivin基因转录和蛋白表达,同样DNR／Br Tet-MNPs组的作用稍弱于DNR／Br Tet-Sol组。
结论：1、自我组装的DNR-MNPs和DNR／Br Tet-MNPs具有水分散性好、粒径小而均匀、载药量较高以及缓释的特点,利用其超顺磁性、通过外加磁场可实现靶向给药。
2、DNR-MNPs在体外对白血病敏感细胞株K562细胞有明显细胞毒作用,通过被细胞内吞后在胞浆内缓慢释放药物,发挥抗肿瘤作用,诱导细胞凋亡。
3、DNR／Br Tet-MNPs在体外对白血病耐药株K562／A02细胞有明显抑制作用,通过下调细胞mdrl／P-gp表达、部分抑制P-gp功能增加细胞内DNR含量,上调bax／bcl-2和caspase3基因转录和蛋白表达、下调survivin基因转录和蛋白表达,诱导耐药细胞凋亡。
4、自制的DNR／Br Tet-MNPs是一种有潜力作为治疗恶性血液病或甚至其他恶性肿瘤的新型磁靶向性药物。