OsMADS18参与调控水稻生长发育的功能研究

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水稻是世界上超过一半的人口的主要粮食,研究水稻的生长和发育的调控机制,意义重大。目前,影响水稻种植最主要的因素为淡水资源,水资源的匮乏严重干扰水稻的正常生长。其它环境因素如干旱胁迫,高温或寒潮,等等,均可导致水稻开花时间紊乱、结实率下降等后果;甚至颗粒无收。植物激素脱落酸(ABA)是经典的植物激素之一,ABA在植物的生长和发育中具有重要的调节作用,是植物抵抗逆境环境的关键激素。本论文通过对水稻APETALA1(AP1)/FRUITFULL(FUL)-like家族的OsMADS18的研究,发现其不仅参与了水稻的开花和结实过程,还参与了水稻营养生长的过程,特别是在分蘖发育过程中发挥了重要的作用。此外,OsMADS18能响应ABA和干旱等逆境胁迫信号,说明OsMADS18在水稻整个发育过程中的地位举足轻重。主要研究结果如下:1.通过分析OsMADS18pro-GUS的表达特征,发现在种子萌发和幼苗时期OsMADS18的表达量很低;随着发育进程的推进其表达量逐步升高,在抽穗期达到最大,随后逐步下降。通过q RT-PCR对OsMADS18在各组织中表达的定量检测,获得了类似的结果。2.分别构建了过量表达(OE)OsMADS18和RNA干扰(RNAi)OsMADS18表达的转基因株系。通过对其表达量的定量检测和分析,筛选到了一系列的株系,并将其中的OE5和OE8以及RNAi5和RNAi6作为本论文的重点研究对象。3.通过表型观察分析,发现RNAi5和RNAi6的成熟种子中积累了高比率的垩白,说明OsMADS18与水稻种子的发育密切相关。进一步的实验结果表明,在RNAi5和RNAi6中其种子的萌发和幼苗的生长都明显迟缓于野生型的。与野生型的相比,OE5和OE8的幼苗的株型较小,主要表现在侧根数量减少和分蘖数减少两方面;暗示过量表达OsMADS18抑制了水稻的营养生长和发育。4.采用Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)/Cas9技术,构建了OsMADS18基因编辑株系;从中筛选到了两个纯合突变体株系,并命名为osmads18-cas9-1(cas9-1)和osmads18-cas9-7(cas9-7)。通过对cas9突变体的表型分析,我们发现这些cas9突变体的早期营养生长与野生型并无明显差异。可是到了成熟期,cas9-1和cas9-7不仅在分蘖数上与野生型存在一定差异而且它们的开花时间均晚于野生型的;不仅如此,它们的结实率明显低于野生型,说明OsMADS18在水稻的个体发育中发挥了重要的作用。5.通过分析OsMADS18启动子的序列,发现其中包含了多个ABA的响应元件(ABA-responsive elements,ABREs),暗示着OsMADS18与ABA之间可能存在一定的联系。进一步的实验结果显示,与野生型和RNAi株系相比OE5和OE8的早期生长对ABA的敏感性降低,它们的叶片的失水速率明显快于野生型和RNAi株系的叶片。RNAi株系和cas9突变体的抗旱性能显著高于野生型。6.OsMADS18能够抑制ABA应答基因如Osb ZIP(basic leucine zipper)家族基因的表达。在OE5和OE8中这些基因的表达水平呈现下降的趋势;相反,在RNAi5和RNAi6及cas9-7中它们的表达水平则呈上升的表型。7.在烟草叶表皮细胞和原生质体中分析了OsMADS18细胞定为的特征。结果显示,OsMADS18具有质膜和核定位的特点。在幼苗时期的叶鞘细胞中,OsMADS18主要分布于细胞膜上,而在随后的叶鞘中,OsMADS18显著的细胞核定位特征。ABA能够促进OsMADS18蛋白质的断裂及其转运到细胞核。这些结果表明OsMADS18很可能属于膜锚定转录因子(MTFs;membrane-bound transcription factors or membrane-associated transcription factors)家族的成员。8.OsMADS18蛋白质包含了四个结构域,当过量表达OsMADS18的N端的三个结构域时,其转基因株系表现出与cas9突变体相类似的表型;然而,当过量OsMADS18的C端的一个结构域时,不会产生明显的异常表型。9.OsMADS18不仅可以和水稻生殖发育相关的OsMADS14和OsMADS15发生相互作用,而且还可以与调控水稻分蘖的OsMADS57发生相互作用。暗示OsMADS18在水稻分蘖过程中可能是通过OsMADS57互作来实现的。
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