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背景胶质母细胞瘤占原发脑恶性肿瘤的48.6%,是最常见的原发脑部恶性肿瘤。胶质母细胞瘤的预后较差,五年生存率仅为7.2%。目前胶质母细胞瘤的主要治疗方式是手术切除,并辅以化疗、放疗,部分病人因昂贵的治疗费用和药物副作用放弃治疗,最终死亡,因此急需一种更有效的治疗方法,延长病人的生存期。根皮素是一种二氢查尔酮,是天然的酚类化合物,在苹果树的果实、果叶和茎干中含量丰富。研究表明,根皮素通过多种细胞信号通路发挥生物学活性功能,如抗癌、抗氧化和抗炎等。我们先前的研究证明,在胶质母细胞瘤中,根皮素可以通过抑制丝氨酸/苏氨酸激酶(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)信号通路诱导胶质母细胞瘤细胞凋亡,因此根皮素可能具备治疗胶质母细胞瘤的潜能。此外,有研究显示根皮素可以通过激活c-JUN氨基末端激酶(c-JUN N-terminal kinase,JNK)通路在小鼠耳蜗毛细胞(House Ear Institute-Organ of Corti 1,HEI-OC1)中发挥抗氧化的保护性作用。根皮素作为天然化合物,可通过其葡萄糖转运体抑制活性产生细胞毒性,因此在根皮素诱导胶质母细胞瘤凋亡时,也会造成正常细胞损伤,导致神经元死亡。研究表明,自噬可以减少病理条件下正常神经元的死亡。自噬是一个降解细胞自身物质的过程,它除了可以降解空间构象紊乱的蛋白质,也可以降解功能损伤的细胞器。微管相关蛋白1轻链3(microtuleassociated protein 1 light chain 3,LC3)是涉及自噬过程中众多蛋白质的成员之一,也是自噬小体形成的重要因素之一,LC3-II常被用作自噬发生的标志物。Akt和JNK蛋白广泛参与细胞的增殖、凋亡、自噬等过程,在不同条件下诱导细胞不同的生理活动。Akt-m TOR和JNK-Beclin-1通路是两条经典的自噬通路,通路中的主要蛋白分别包括Akt、m TOR、p70核糖体蛋白s6激酶(p70 ribosomal protein s6 kinase,p70s6k)和JNK、c-JUN、自噬效应蛋白Beclin-1。SH-SY5Y细胞已被广泛用作拟神经细胞模型,是研究神经元死亡最常用的细胞模型。本研究应用SH-SY5Y细胞作为神经元体外模型,探讨根皮素能否诱导SH-SY5Y细胞自噬及其作用机制,以及调控自噬能否减轻根皮素的细胞毒性。目的探讨根皮素能否通过Akt-m TOR和JNK-Beclin-1信号通路诱导SH-SY5Y细胞自噬,以及调控自噬能否降低根皮素对SH-SY5Y的细胞毒性。为根皮素抑制胶质母细胞瘤时降低对正常神经元的损伤作用提供依据。方法人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞购自美国ATCC公司。用CCK-8法检测根皮素对SH-SY5Y细胞活力的影响;用激光共聚焦成像观察根皮素对SH-SY5Y细胞的LC3-II蛋白荧光的影响;用透射电子显微镜观察根皮素对SH-SY5Y细胞自噬小体形成的影响。蛋白质印迹分析检测根皮素、氯喹、巴弗洛霉素、SC79、SP600125、雷帕霉素、Akt抑制剂对SH-SY5Y细胞LC3-II、p62、p-Akt、p-p70s6k、p-m TOR、p-JNK、Beclin-1、p-c-JUN蛋白表达的影响;用c-JUN和Beclin-1慢病毒转染SH-SY5Y细胞,用蛋白质免疫印迹分析检测根皮素对c-JUN KD和Beclin-1 KD细胞的LC3-II蛋白表达的影响;用CCK-8法检测自噬抑制剂3-MA和自噬增强剂Rap对SH-SY5Y细胞活力的影响;用流式细胞术和Hoechst33342/PI双染色实验检测自噬抑制剂3-MA和自噬增强剂Rap对SH-SY5Y细胞死亡的影响。结果1.根皮素的细胞毒性:(1)CCK-8分析显示:根皮素(0μM、100μM、200μM、400μM)处理SH-SY5Y细胞12h、24h、48h。在12h和24h组中,当根皮素浓度≥200μM时,随着根皮素浓度升高,细胞活力逐渐下降,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05);在48h组中,当根皮素浓度≥100μM时,随着根皮素浓度升高,细胞活力逐渐下降,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)Hoechst33342/PI双重染色实验和流式细胞术分析显示:根皮素(200μM)处理SH-SY5Y细胞24h,根皮素组的细胞死亡率升高,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。说明根皮素对SH-SY5Y具有细胞毒性。2.根皮素诱导SH-SY5Y细胞自噬:Western Blot分析显示:(1)根皮素(200μM)处理SH-SY5Y细胞0h,0.5h,1h,3h,6h,12h,24h,随着根皮素作用时间延长,LC3-II蛋白表达增加,p62蛋白表达下降,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05);根皮素处理SH-SY5Y细胞24h,随着浓度升高(0μM,5μM,10μM,25μM,50μM,100μM,200μM),LC3-II蛋白表达增加,p62蛋白表达下降,根皮素处理浓度为100μM和200μM时的蛋白表达与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)加入抑制自噬小体降解的巴弗洛霉素A1(bafilomycin A1,BAF)和氯喹(chloroquine,CQ)后,LC3-II蛋白表达水平进一步升高,与根皮素组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。说明根皮素诱导SH-SY5Y细胞自噬是由于自噬小体LC3-II形成增多。(3)激光共聚焦成像显示:根皮素(200μM)处理SH-SY5Y细胞24h,根皮素组的LC3-II荧光强度增加,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.001)。(4)透射电子显微镜:根皮素(200μM)处理SH-SY5Y细胞24h,根皮素组中出现自噬小体,对照组显示正常超微结构。说明根皮素可以通过促进LC3-II形成诱导SH-SY5Y细胞自噬。3.根皮素通过抑制Akt-m TOR通路诱导SH-SY5Y细胞自噬:Western Blot分析显示:(1)根皮素(200μM)处理SH-SY5Y细胞0h,0.5h,1h,3h,6h,12h,24h,p-Akt、p-m TOR和p-p70s6k的蛋白表达水平下降。(2)Akt抑制剂(5m M)预处理1h,根皮素(200μM)处理24h,根皮素联合Akt抑制剂组的p-p70s6k水平下降,LC3-II水平增加,与根皮素组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)Akt激活剂SC79(10μM)预处理1h,根皮素(200μM)处理24h,根皮素联合SC79组的p-p70s6k水平增加,LC3-II水平下降,与根皮素组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)m TOR抑制剂雷帕霉素(rapamycin,Rap)(100n M)预处理1h,根皮素(200μM)处理24h,根皮素联合Rap组的p-p70s6k水平下降,LC3-II蛋白水平增加,与根皮素组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。说明根皮素通过抑制Akt-m TOR通路诱导SH-SY5Y细胞自噬。4.根皮素通过激活JNK-Beclin-1通路诱导SH-SY5Y细胞自噬:(1)根皮素(200μM)处理SH-SY5Y细胞24h,根皮素组的p-JNK、p-c-JUN、Beclin-1水平显著增加,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)JNK抑制剂SP600125(20μM)预处理1h,根皮素(200μM)处理24h,根皮素联合SP600125组的p-JNK、p-c-JUN、Beclin-1和LC3-II水平显著下降,与根皮素组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)用c-JUN慢病毒转染SH-SY5Y细胞,根皮素处理c-JUN KD组的Beclin-1和LC3-II蛋白水平下降,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。(4)用Beclin-1慢病毒转染SH-SY5Y细胞,根皮素处理Beclin-1 KD细胞组的LC3-II蛋白水平下降,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.01)。说明根皮素通过激活JNK-Beclin-1通路诱导SH-SY5Y细胞自噬。5.调控自噬影响根皮素的细胞毒性:(1)自噬抑制剂3-MA(10m M)预处理SH-SY5Y细胞1h,根皮素(200μM)处理24h,激光共聚焦成像和Western Blot分析显示,根皮素联合自噬抑制剂3-MA组的LC3-II蛋白荧光减弱,LC3-II蛋白表达下降,与根皮素组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)自噬抑制剂3-MA(10m M)预处理SH-SY5Y细胞1h,根皮素(200μM)处理24h,CCK-8结果显示,根皮素联合自噬抑制剂3-MA组的细胞活力显著下降,与根皮素组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)Hoechst33342/PI双染实验和流式细胞术结果显示,根皮素联合自噬抑制剂3-MA组的细胞死亡率升高,与根皮素组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。(4)自噬增强剂Rap(100n M)预处理SH-SY5Y细胞1h,根皮素(200μM)处理24h,Hoechst33342/PI双染实验和流式细胞术结果显示,根皮素联合自噬增强剂Rap组的细胞死亡率下降,与根皮素组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。说明在根皮素处理神SH-SY5Y细胞时,抑制自噬可以增加根皮素的细胞毒性,增强自噬可以减轻根皮素的细胞毒性。结论1.根皮素通过抑制Akt-m TOR通路诱导SH-SY5Y细胞自噬。2.根皮素通过激活JNK-Beclin-1通路诱导SH-SY5Y细胞自噬。3.增强自噬可以减轻根皮素对SH-SY5Y的细胞毒性。