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目的脓毒症诱发肝损伤的发病机制并不明确,有动物实验提示中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracelluar traps,NETs）可能引起肝细胞损伤。本研究的主要目的是探讨NETs在脓毒症诱发肝损伤中的作用,并通过体内、体外实验初步探索其作用机制,旨在从新的视角解释脓毒症肝损伤的发生,为临床防治脓毒症肝损伤提供新的理论依据。第一部分临床水平探讨NETs与脓毒症肝损伤的相关性方法（1）采用前瞻性观察性研究方法,选择2019年03月至2019年08月无锡市人民医院重症医学科收治的患者（符合脓毒症3.0诊断标准）作为研究对象,根据肝损伤诊断标准将患者分为脓毒症非肝损伤组和脓毒症肝损伤组;选择同期住院的非脓毒症患者作为非脓毒症组;选择本院体检中心健康体检者作为健康对照组。（2）记录患者入ICU时及健康体检者体检当天的年龄、性别、白细胞（WBC）、中性粒细胞（PMN）、前降钙素（PCT）、总胆红素（TBIL）、谷丙转氨酶（ALT）、凝血酶原时间（PT）、国际标准化比值（INR）,计算患者急性生理学与慢性健康状况评分Ⅱ（APACHE Ⅱ）、序贯器官衰竭评分（SOFA）,计算患者28天病死率。（3）取外周静脉血,使用PicoGreen荧光染料定量检测血浆NETs水平,以游离DNA（cf-DNA/NETs）水平表示,同时使用Cell Death Detection ELISA试剂盒半定量测定血浆NETs水平,以细胞质组蛋白相关DNA片段（核小体复合物）/NETs水平表示;采用细胞免疫荧光染色进行NETs定性检测。（4）将脓毒症肝损伤患者根据治疗后肝功能情况分为脓毒症肝损伤好转组和脓毒症肝损伤恶化组,分别比较治疗前后NETs定量水平变化。（5）提取健康对照组、脓毒症非肝损伤组、脓毒症肝损伤组PMN并进行体外培养,使用PicoGreen荧光染料定量检测细胞上清cf-DNA/NETs水平。（6）根据脓毒症肝损伤患者28天临床转归分组,描绘ROC曲线,同时计算AUC面积,分析外周血NETs水平对脓毒症肝损伤患者预后的预测价值。结果（1）最终纳入脓毒症非肝损伤患者21例,脓毒症肝损伤患者15例,非脓毒症患者20例,健康体检者20例。4组患者间年龄、性别比较均无统计学差异（P＞0.05）,提示各组患者基础情况相仿,相互之间具有可比性。（2）脓毒症非肝损伤组与脓毒症肝损伤组外周血cf-DNA/NETs水平、核小体复合物/NETs水平及WBC、PMN均高于健康对照组和非脓毒症组,并且APACHE Ⅱ评分、SOFA评分、PCT、28天病死率均高于非脓毒症组,且脓毒症肝损伤组外周血cf-DNA/NETs 水平、核小体复合物/NETs 水平及 PCT、28 天病死率均高于脓毒症非肝损伤组,以上各组比较具有统计学差异（P＜0.05）。（3）肝损伤好转组患者,经过保肝治疗,随着肝功能好转,患者NETs水平较治疗前下降,治疗前后比较具有统计学差异（P＜0.05）;而肝损伤恶化组患者,随着肝功能的恶化,患者NETs水平较治疗前升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）。（4）体外培养PMN结果显示,正常培养时健康对照组无NETs产生,脓毒症非肝损伤组和脓毒症肝损伤组均有少量NETs产生;加入PMN刺激剂佛波醇-12-肉豆蔻酯-13-乙酸（PMA）刺激后,3组PMN均较正常培养时产生更多的NETs。定量分析显示,脓毒症肝损伤组细胞上清cf-DNA/NETs水平明显高于脓毒症非肝损伤组,差异具有统计学意义（P＜0.01）。（5）15例脓毒症肝损伤患者28天存活4例（占26.7%）,死亡11例（占73.3%）,死亡组患者入院时外周血cf-DNA/NETs水平明显高于存活组,两者比较具有统计学差异（P＜0.05）。ROC曲线计算分析,外周血NETs水平预测脓毒症肝损伤患者28天死亡的AUC值为0.932;当最佳截断值选为266.81μg/L时,其敏感度为90.9%,特异度为75.0%,约登指数为0.659。结论（1）脓毒症肝损伤患者PMN分泌NETs功能发生了进一步改变。（2）NETs与脓毒症肝损伤的发生存在着一定的相关性。（3）外周血NETs水平对脓毒症肝损伤患者的预后具有一定的预测价值。第二部分动物水平明确NETs在脓毒症肝损伤中的作用方法（1）动物分组和模型建立,将C57BL/6N小鼠随机数字表法分成正常对照组、LPS模型组,将PAD4敲基因小鼠作为敲基因组。（2）观察各组小鼠的生存状态,包括活动状况、精神状态、对外界反应、进食和饮水等存活情况。（3）使用全自动生化分析仪检测小鼠血清中ALT、AST和TBIL的含量。（4）使用PicoGreen荧光定量检测试剂盒检测小鼠外周血浆cf-DNA/NETs定量水平。（5）使用ELISA试剂盒检测小鼠血清、肝组织匀浆的IL-6和TNF-α表达水平。（6）使用HE染色法观察各组小鼠肝脏组织病理情况,组织免疫荧光染色法观察各组NETs浸润肝组织情况。结果（1）正常对照组小鼠一切活动正常,LPS模型组小鼠腹腔注射LPS后,小鼠逐渐浑身冰凉、呼吸急促、蜷缩不动以及触之不动,PAD4敲基因组小鼠整体情况略好于LPS模型组小鼠。（2）全自动生化分析仪检测结果显示:LPS模型组小鼠、PAD4敲基因组小鼠血清里ALT、AST和TBIL的表达水平明显高于正常对照组小鼠（P＜0.05）,但是PAD4敲基因组小鼠血清里ALT、AST和TBIL的表达水平明显低于LPS模型组小鼠（P＜0.05）。（3）PicoGreen荧光定量检测试剂盒检测结果显示:LPS模型组小鼠外周血浆中cf-DNA/NETs的含量明显高于正常对照组小鼠（P＜0.05）,PAD4敲基因组小鼠外周血浆中cf-DNA/NETs的含量略高于正常对照组小鼠（P＜0.05）,但是PAD4敲基因组小鼠外周血浆中cf-DNA/NETs的含量明显低于LPS模型组小鼠（P＜0.05）。（4）ELISA试剂盒检测结果显示:LPS模型组小鼠、PAD4敲基因组小鼠血清、肝组织匀浆中IL-6、TNF-α的含量高于正常对照组（P＜0.05）,但是PAD4敲基因组小鼠血清、肝组织匀浆中IL-6、TNF-α的含量低于LPS模型组（P＜0.05）。（5）肝脏组织免疫荧光染色结果显示:正常对照组中,小鼠肝脏中未见NETs浸润表达;LPS模型组中,小鼠肝脏中可见NETs浸润表达;PAD4敲基因组小鼠肝脏中,可见少量NETs浸润表达。（6）肝脏组织HE染色结果显示:正常对照组中,小鼠肝脏细胞形态完整,结构清楚,呈索状排列;LPS模型组中,小鼠肝脏细胞结构排列紊乱,可见细胞变形肿胀或萎缩,部分呈气泡样改变,可见炎症细胞浸润,伴有细胞坏死;PAD4敲基因组小鼠肝脏细胞结构排列情况较LPS模型组有改善,细胞变形情况减轻,炎性细胞浸润情况也有所减少。结论（1）在LPS诱导的脓毒症肝损伤小鼠模型中,抑制NETs产生可减少炎症细胞因子的产生,明显减轻脓毒症诱发的肝损伤。（2）NETs可能参与了脓毒症肝损伤的发生、发展。第三部分细胞水平初步探讨NETs激活肝细胞凋亡的途径方法（1）使用CCK-8法检测NETs干预对L02细胞活力的影响。（2）使用ELISA法检测NETs干预后细胞培养上清中ALT、AST的水平。（3）分别使用DNase Ⅰ、肝素、NE抑制剂、MPO抑制剂预干预,使用CCK-8法检测NETs不同成分对L02细胞活力的影响。（4）使用流式细胞仪分析检测NETs干预对L02细胞凋亡的影响。（5）使用流式细胞仪分析检测NETs干预L02细胞后对ROS的表达水平的影响。（6）使用ELISA法检测NETs对L02细胞内MDA、GSH表达水平的影响。（7）使用 RT-qPCR 和 Western blot 检测 NETs 对 L02 细胞内 Nrf2 mRNA 转录、总蛋白和核蛋白的表达水平的影响。（8）使用 RT-qPCR 和 Western blot 检测 NETs 对 L02 细胞内 HO-1 mRNA 转录、蛋白表达水平的影响。（9）分别使用Nrf2抑制剂、Nrf2激活剂预培养,使用RT-qPCR和Western blot检测NETs对L02细胞内Caspase-3蛋白表达、Bcl-2和Bax mRNA转录和蛋白表达水平的影响。结果（1）CCK-8检测结果显示:与正常对照组相比,L02细胞经NETs干预后,细胞活力下降,NETs组细胞活力下降至55%左右,并且具有统计学差异（P＜0.05）。（2）ELISA法检测结果显示:与正常对照组相比,L02细胞经NETs干预后,NETs组细胞上清中ALT、AST的表达水平高于正常对照组,并且具有统计学差异（P＜0.05）。（3）CCK-8检测结果显示:与正常对照组相比,NETs组细胞活力下降到53%左右（P＜0.05）,NETs+DNase Ⅰ 组细胞活力下降到 58%左右（P＜0.05）,NETs+DNaseⅠ组细胞活力与NETs组相仿（P＞0.05）;和正常对照组比较,NETs组细胞活力下降到53%左右（P＜0.05）,而NETs+Heparin组细胞活力下降到82%左右（P＜0.05）,但是NETs+Heparin组细胞活力高于NETs组（P＜0.05）;和正常对照组比较,NETs组细胞活力下降到72%左右（P＜0.05）,而NETs+NEI组细胞活力下降到62%左右（P＜0.05）,但是NETs+NEI组细胞活力与NETs组相仿（P＞0.05）;和正常对照组比较,NETs组细胞活力下降到58%左右（P＜0.05）,而NETs+MPOI组细胞活力下降到84%左右（P＜0.05）,但是NETs+MPOI组细胞活力高于NETs组（P＜0.05）。（4）流式细胞仪分析检测结果显示:与正常对照组相比,L02细胞经NETs干预后,NETs组细胞凋亡率高于正常对照组,并且具有统计学差异（P＜0.05）。（5）流式细胞仪分析检测结果显示:与正常对照组相比,L02细胞经NETs干预后,NETs组ROS的表达水平高于正常对照组,并且具有统计学差异（P＜0.05）。（6）使用ELISA法检测结果显示:与正常对照组相比,L02细胞经NETs干预后,NETs组MDA的含量明显较正常对照组高,GSH的含量较正常对照组低,并且具有统计学差异（P＜0.05）。（7）使用RT-qPCR和Western blot检测发现:相较于正常对照组,NETs组Nrf2 mRNA转录水平下降,NETs组Nrf2总蛋白和核蛋白表达水平降低,均具有统计学差异（P＜0.05）。（8）使用RT-qPCR和Western blot检测发现:相较于正常对照组,NETs组HO-1 mRNA转录水平下降,NETs组HO-1蛋白表达水平降低,使用ML385干预则HO-1表达进一步降低,使用NK252干预则HO-1表达较NETs组表达升高,且以上差异均有统计学意义（P＜0.05）。（9）使用RT-qPCR和Western blot检测发现:相较于正常对照组,NETs干预可引起cleaved-caspase-3蛋白表达增加,使用ML385干预则cleaved-caspase-3表达进一步增加,使用NK252干预则cleaved-caspase-3表达较NETs组表达减少,且具有统计学差异（P＜0.05）;与正常对照组相比,NETs干预可引起Bcl-2mRNA转录水平减少和蛋白水平降低、Bax mRNA转录水平增加和蛋白表达水平升高、Bcl-2/Bax比值下降,使用ML385干预Bcl-2表达较NETs组进一步下降、Bax表达则升高、Bcl-2/Bax比值进一步下降,使用NK252干预Bcl-2表达较NETs组增加、Bax表达则下降、Bcl-2/Bax 比值升高,且具有统计学差异（P＜0.05）。结论（1）NETs干预后,可诱发肝细胞损伤,并且在体外起主要作用的成分为组蛋白和 MPO。（2）NETs干预后,可导致致肝细胞内ROS、MDA水平升高,GSH含量下降,诱发肝细胞内氧化应激,抑制抗氧化酶的产生。（3）NETs干预后,可升高cleaved-caspase-3、Bax的表达水平,降低Bcl-2表达水平,诱导肝细胞凋亡。（4）NETs可能通过抑制肝细胞内Nrf2/HO-1信号通路基因的表达水平,从而激活肝细胞凋亡。