【摘 要】
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有尾两栖类是现存最低等的陆生脊椎动物,是地球上由水生转向陆生较原始的现存动物.它对研究生物的进化有着重要科研价值.小鲵科是有尾目中最原始的一个类群,在有尾类研究中处
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有尾两栖类是现存最低等的陆生脊椎动物,是地球上由水生转向陆生较原始的现存动物.它对研究生物的进化有着重要科研价值.小鲵科是有尾目中最原始的一个类群,在有尾类研究中处于重要地位.该文根据两栖类动物线粒体两端的特征序列确定编码区所在位置,设计特异性引物采用PCR技术从小鲵科基因组DNA中扩增出线粒体基因细胞色素b和16S rRNA部分编码序列,扩增产物经过1.0%的琼脂糖凝胶EB电泳、纯化、回收后转化,再应用抗生素筛选法随机挑取阳性克隆进行PCR检测.鉴定阳性克隆后对重组质粒进行测序.测序结果采用DNASTAR软件包(DNASTAR Inc,1996)中的MegAlign程序对同源序列进行排列,并经人工仔细核查.在此基础上,序列输入MEGA2.1软件包中计算不同序列间的变异位点、简约信息位点数、颠换百分比、转换/颠换比率和两两序列的遗传距离;用MEGA2.1软件基于Kimura 2-parameter距离采用邻近法(Neighbor-Joining)构建分子系统树,同时也用PHYLIP3.6软件包(Felsenstein,2001)使用Heuristic功能搜寻最大简约法(Maximum Parsimony)和最大拟然法(Maximum Likehood)的系统重建.实验结果显示线粒体基因细胞色素b和16S rRNA基因PCR扩增片段在琼脂糖凝胶电泳结果中显示出清晰的特异性扩增条带,经连接及转化实验,在LB固体培养基上长出较多阳性克隆.随机挑菌进行PCR检测,其结果皆为阳性克隆.说明成功克隆出新疆北鲵和秦巴北鲵的线粒体基因细胞色素b和16S rRNA部分编码序列,并将其重组入原核表达载体.对重组质粒进行测序的结果经DNASTAR、MEGA2.1、PHYLIP3.6软件包的不同方法(Neighbor-Joining、Maximum Parsimony、Maximum Likehood)构建出的分子系统树基本相同.结果表明山溪鲵、无斑山溪鲵、北方山溪鲵是三个有效种;巴鲵是有效属且与秦巴北鲵的亲缘关系比较近;黄斑拟小鲵不是秦巴北鲵的同物异名.该实验结果为深入开展小鲵科的分子系统学研究奠定了分子水平上的基础.
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