论文部分内容阅读
第一部分:
目的:TMP1是利用鞭毛多肽库筛选得到,该肽能靶向识别恶性肿瘤原位灶、转移灶甚至是微小转移灶,根据筛选原理TMP1应该与肿瘤细胞膜某种蛋白分子结合,因此本研究目的是筛选出TMP1在细胞表面的受体蛋白;并可能得到新的肿瘤转移相关蛋白;为解释TMP1靶向作用、入胞机理和促凋亡作用提供实验依据。
方法:借助斑点杂交和Western blot初步证实前列腺癌细胞1E8细胞的某种膜蛋白能与TMP1发生相互作用;利用pull-down(亲和层析)方法分离与TMP1相互作用的膜蛋白,质谱分析进行混合物的蛋白质鉴定与测序,获得受体蛋白。通过共聚焦免疫荧光、竞争拮抗抑制试验、流式细胞仪、Western blot和PCR方法进行受体验证工作。
结果:Western blot证实TMP1与分子量约为26-28KD的前列腺癌细胞(PC-3M-1E8)蛋白发生特异性结合;与TMP1相互的前列腺癌细胞(PC-3M-1E8)膜蛋白样品经SDS-PAGE,改良的蓝银染色方法对蛋白进行染色后,与对照侧相比,实验侧发现在分子量约为25-30KD位置出现一特异性的蛋白染色带。分离该蛋白带进行液相串联质谱分析后,证实该该蛋白为A蛋白(由于保密原因,论文中称该蛋白为A蛋白);共聚焦显微镜观察A蛋白在细胞膜、细胞质和细胞核均有表达,但以胞浆为主;竞争拮抗抑制试验发现不同浓度的抗A蛋白抗体可以不同程度的抑制TMP1在肿瘤细胞的荧光分布强度,而且呈剂量依赖性;流式细胞仪技术也发现肿瘤细胞预先用抗A蛋白抗体处理后,可以抑制TMP1对细胞的促凋亡作用。
结论:A蛋白为TMP1的受体,该蛋白是与肿瘤转移相关的蛋白;A蛋白与TMP1相互结合促进TMP1的入胞作用并发挥肽的促凋亡作用。
第二部分:
目的:由于TMP1有很靶向于肿瘤及其转移灶的功能,因此本部分是借助TMP1的靶向性,携带细胞毒性肽,用于肿瘤的靶向治疗。
方法:体外合成TMP1-TAT-NBD,svTMP1-TAT-NBD(变异体),TMP1-NBD,TAT-NBD,TAT,FITC-TMP1-TAT-NBD,FITC-svTMP1-TAT-NBD和FITC-TMP1-NBD;细胞免疫荧光分析FITC-TMP1-TAT-NBD,FITC-svTMP1-TAT-NBD和FITC-TMP1-NBD这三段肽对不同转移潜能肿瘤细胞(前列腺癌(PC-3M-1E8和PC-3M-2B4)和乳腺癌((MDA-MB-435S,MDA-MB-231和MCF-7)),耐药和对化药物敏感相配对的卵巢癌细胞(OV2008和C13K)以及正常小鼠纤维细胞(NIH/3T3)的亲和能力;CCK-8和流式细胞仪方法检测六种肽对配对细胞的毒性作用以及细胞凋亡的影响;电镜观察肽作用下的超微结构的改变;Western blot验证相关的肽段对NF-κB,IKB-α和GSK-3β的影响,并运用NF-κB激活-核转运试验检测是否发生NF-κB激活-核转运;动物体内成像证实肽是否对肿瘤及其转移灶具有靶向性识别作用;并用TMP1-TAT-NBD和svTMP1-TAT-NBD进行肿瘤治疗试验。
结果:体外实验证明,TMP1-NBD与TMP1相比,对高转移肿瘤细胞和耐药细胞株的亲和力明显减弱;TMP1-TAT-NBD对高转移肿瘤细胞则表现比TMP1更高亲和性的入胞效应,这段肽对高转移肿瘤和耐药的肿瘤细胞表现为相同的亲和力;CCK-8的结果表明,TMP1-TAT-NBD对肿瘤细胞的毒性最大,TMP1-NBD对细胞的影响与对照肽相似,细胞毒性非常弱;流式细胞仪结果与CCK-8的结果表现为一致性,而且对细胞周期有抑制作用,主要阻滞在G1期;光镜下,TMP1-TAT-NBD致使PC-3M-1E8细胞短时间内大量崩解,满视野为黑褐色的细胞碎屑,超微电镜证实在肿瘤细胞的胞膜和核膜完全遭到破坏,细胞解体,同时也观察到,在TMP1-TAT-NBD的作用下,部分细胞胞浆内大量的糖原聚集;TMP1-TAT-NBD可以引起细胞核内的NF-κB(P65)表达减少,核转运实验的共聚焦结果也证实核内的活性NF-κB的定位也明显减少;另一方面,TMP1-TAT-NBD可以引起胞浆内GSK-3β和IKB-α的表达下降;在动物体内,FITC-TMP1-TAT-NBD对肿瘤有很好的识别能力,而对正常的器官则没有向性,FITC-svTMP1-TAT-NBD对肿瘤无靶向性识别能力;TMP1-TAT-NBD体内治疗表明,该肽对肿瘤组织有明显的抑制作用。而svTMP1-TAT-NBD无效应。
结论:TMP1-TAT-NBD对高转移肿瘤和耐药的肿瘤细胞有高亲和力,对低转移细胞、药物敏感细胞和正常细胞无结合力;TMP1-TAT-NBD有明显的致细胞毒作用,引起肿瘤细胞阻滞在G1期;TMP1-TAT-NBD可以引起NF-κB(P65)的活性和下调胞浆内IKB-α的表达,致使胞浆内糖原大量聚集和GSK-3β表达下降;TMP1-TAT-NBD对体内肿瘤组织有很好的靶向性及肿瘤杀伤作用。