丙谷二肽(AQ)是一种功能二肽,具有水溶性高、热稳定性好、生物利用率高等优良特点,在临床医疗、术后康复、运动保健等领域应用广泛。AQ的生产目前主要采用化学合成法,由于化学法步骤繁琐,耗时耗力、产率低、伴随副产物产生,因此急需建立绿色高效合成AQ的方法。本研究利用代谢工程手段,构建了谷氨酰胺合成模块和AQ合成模块,通过筛选获得催化性质优良的谷氨酰胺合成酶(GlnA)和L-氨基酸-连接酶(BacD),通过RBS优化和拷贝数优化,构建能够高效催化谷氨酸(L-Glu)和丙氨酸(L-Ala)合成丙谷二肽的重组大肠杆菌。所取得的结果如下:1、在大肠杆菌BW25113中表达L-氨基酸-连接酶(BacD),构建AQ合成模块,获得重组菌pYB1a-BsbacD/BW,利用该重组菌,以丙氨酸和谷氨酰胺为底物进行全细胞催化初步实现了AQ的合成。2、通过CRISPR技术敲除大肠杆菌BW中编码二肽降解酶的基因pepABDN和编码二肽转运蛋白的基因簇dppA-F获得大肠杆菌AQ09,有效缓解了AQ的降解。重组菌pYB1a-BsbacD/AQ09在以L-Gln和L-Ala为底物的全细胞催化体系中反应18小时,AQ产量达到3.3mM,比出发菌株pYB1a-BsbacD/BW(产量2.0mM)提高65.0%。3、为了降低原料的成本,构建Gln合成模块:筛选获得能够高效转化L-Glu为L-Gln的谷氨酰胺合成酶CgGlnA,表达CgGlnA的重组菌以L-Glu为底物全细胞催化,L-Gln产量达到22.4mM,摩尔得率为44.8%。通过敲除BW中编码谷氨酰胺酶的基因glsA、glsB和编码GlnA亚基修饰相关酶的基因glnE、glnB获得重组菌AQ06,将pYB1a-CgglnA导入AQ06获得重组菌株pYB1a-CgglnA/AQ06。重组菌pYB1aCgglnA/AQ06以L-Glu为底物全细胞催化,L-Gln产量达到46.5mM,较出发菌株pYB1a-CgglnA/BW提高107.6%。4、通过叠加AQ合成模块和Gln合成模块,获得具有AQ06和AQ09底盘敲除性状的大肠杆菌AQ10,将共表达CgglnA和BsbacD的质粒pYB1s-CgglnA-BsbacD导入AQ10获得菌株pYB1s-CgglnA-BsbacD/AQ10。该菌在以L-Glu和L-Ala为底物的全细胞催化体系中反应6小时,AQ产量达23.6 Mm,比出发菌株pYB1aBsbacD/BW提高了1080%。5、合成途径的进一步优化:通过优化RBS和质粒拷贝数,调节BacD蛋白表达获得重组菌株YGS176300,该重组菌在以L-Glu和L-Ala为底物的全细胞催化体系中反应6小时,AQ产量达32.4 mM,较pYB1s-CgglnA-BsbacD/AQ10提高79.1%。进一步,通过更换质粒载体为中拷贝质粒pLB1s,获得重组菌株LGS176300,该菌株AQ产量达22.8mM,仅较菌株YGS176300降低9.0%,但培养后菌液浓度提高一倍。6、全细胞催化合成AQ的条件优化:通过全细胞催化条件,如温度、pH、补糖等的摸索,优化催化反应体系:100mM L-Glu和125mM L-Ala,葡萄糖50mM(分五次,每3小时补加一次),pH 9.0,30℃,反应18小时AQ产量达到65.6mM,LGlu的摩尔得率为65.6%。