论文部分内容阅读
目的:急性心肌梗死(acute myocaedial infarction,AMI)是属于急性冠脉综合征(acute coronary syndromes,ACS)的一种急性心肌缺血性疾病,指冠状动脉在发生急性堵塞时,心肌发生缺血、坏死的一种严重冠心病。该病起病急、病情进展迅速、致死率及致残率高,给全球公民的健康带来严重威胁。由于该病发病率极高,可以导致多种疾病如心力衰竭、心律失常、心肌炎、心脏瓣膜病、心源性休克等,所以对于及时针对AMI的预防和治疗已经成为了临床工作中亟待解决的难题。然而,目前除了冠状动脉造影等有创性检查手段,尚且缺乏早期识别疾病的生物学标志物。所以我们应用iTRAQ技术、动物学实验、细胞学实验等方法,比较和鉴定AMI中的差异表达蛋白质,从而发现与AMI相关的生物学标志物,并探究其在AMI发生发展过程中的机制。研究方法:第一部分基于iTRAQ技术的急性心肌梗死特异性蛋白质的筛选及验证1)采用iTRAQ技术检测在AMI组(包括STEMI、NSTEMI)和对照组患者血清中差异表达的蛋白质,并进行一系列生物信息分析,以期筛选出与急性心肌梗死相关的差异表达蛋白质;2)采用Elisa法验证SAA1是否在AMI患者血清中高表达,判断其升高是否可作为AMI发生的独立危险因素,以及应用ROC曲线分析法对该蛋白诊断AMI的特异度、灵敏度进行评估。第二部分探究大鼠急性心肌缺血再灌注后SAA1的变化及心肌炎性损伤的影响1)通过结扎大鼠的左前降支30min,松开结扎线120min制备大鼠急性心肌缺血再灌注模型;2)H&E染色观察大鼠心肌组织病理改变;3)TTC染色法观察心肌梗死情况,并计算梗死面积百分比;4)测定大鼠血清CK-MB、LDH水平评估心肌损伤情况;5)Elisa法测定大鼠血清中SAA1的水平;6)Western blot法检测心肌组织中NLRP3、caspase-1的表达情况。第三部分探究SAA1对心肌细胞缺氧/复氧后细胞焦亡的影响及作用机制1)细胞分组如下:(A)Control组:使用完全培养基,于正常条件下培养细胞;(B)H/R组:将正常条件下培养的H9C2细胞更换为无糖、无血清的DMEM培养基后,置于三气混合培养箱中(94%N2,5%CO2,1%O2)培养4h完成缺氧过程,后更换为正常完全培养基置于正常条件下继续培养2h完成复氧过程;(C)H/R+SAA1组:应用SAA1预处理细胞24h,后进行缺氧/复氧过程;(D)H/R+SAA1+BAY组:预先应用5μM浓度的BAY11-7082(NLRP3抑制剂)处理细胞1h,依次应用SAA1预处理细胞24h,后进行缺氧/复氧过程。2)CCK-8法测量各组心肌细胞活性;3)测定LDH水平评估心肌细胞损伤程度;4)Elisa法测定血清IL-1β表达水平;5)细胞免疫荧光法观察NLRP3、caspase-1在细胞内表达情况;6)Calcein-AM/PI活死细胞染色法观察细胞焦亡情况;7)Western blot法检测细胞中NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β的表达情况。结果:第一部分基于iTRAQ技术的急性心肌梗死特异性蛋白质的筛选及验证1)本部分我们共鉴定出95种差异表达蛋白质,其中在STEMI和NSTEMI组中比较中筛选出44种蛋白质,NSTEMI和Control组中比较中筛选出48种蛋白质,STEMI和Control组中比较中筛选出28种蛋白质,且在STEMI、NSTEMI、Control三组之间比较存在24种共同差异表达的蛋白质。2)SAA1在STEMI组、NSTEMI组患者血清中的水平明显高于Control组;3)ROC曲线分析提示SAA1诊断AMI对应的灵敏度为84.9%,特异度为90.4%,对应的曲线下面积值(AUC)为0.927,对AMI诊断有很高的准确性;4)多因素回归分析法提示SAA1升高可作为AMI发生的独立危险因素。第二部分探究大鼠急性心肌缺血再灌注后SAA1的变化及心肌炎性损伤的影响1)H&E染色结果提示I/R组心肌组织发生明显的损伤;2)TTC染色结果提示I/R组心肌梗死面积明显高于Sham组(P<0.01);3)I/R组血清CK-MB、LDH水平均高于Sham组(P值均小于0.05);4)Elisa测定结果提示I/R组血清SAA1水平高于Sham组(P<0.05);5)Western blot法测定I/R组心肌组织中NLRP3、Caspase-1蛋白质的表达水平明显高于Sham组(P值均小于0.05)。第三部分探究SAA1对心肌细胞缺氧/复氧后细胞焦亡的影响及作用机制1)CCK-8法检测结果提示H/R组较Control组心肌细胞活力明显下降(P<0.01),给予SAA1(10μg/m L)干预后,细胞活力较H/R组明显下降(P<0.01);2)LDH水平在H/R组明显高于Control组(P<0.01),给予SAA1干预后,LDH水平进一步升高(P<0.05)。此外与单纯应用SAA1干预H/R心肌细胞后,加入NLRP3抑制剂(BAY11-7082)可使LDH水平可明显下降(P<0.05);3)采用Elisa法测定结果提示H/R组IL-1β水平明显高于Control组(P<0.01),给予SAA1干预后,IL-1β水平进一步升高(P<0.01);与单纯应用SAA1干预H/R心肌细胞后,加入BAY11-7082可使IL-1β水平可明显下降(P<0.01);4)细胞免疫荧光结果提示H/R组细胞内NLRP3、Caspase-1的表达明显高于Control组,给予SAA1干预后的表达高于H/R组;与单纯应用SAA1干预H/R心肌细胞相比,加入BAY11-7082可使NLRP3、Caspase-1的表达明显下降;5)Calcein-AM/PI活死细胞染色法结果提示H/R组细胞焦亡程度明显高于Control组,给予SAA1干预后的细胞焦亡程度高于H/R组;与单纯应用SAA1干预H/R心肌细胞后,加入BAY11-7082可使细胞焦亡程度明显下降;6)Western blot法检测结果提示H/R组细胞NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β蛋白质相对表达量显著高于Control组(P值均小于0.05),给予SAA1干预后各指标的表达量明显高于H/R组(P值均小于0.05);与单纯应用SAA1干预H/R心肌细胞后相比,加入BAY11-7082可使NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β蛋白质相对表达量显著下降(P值均小于0.05)。结论:1)利用iTRAQ技术共筛选出了95种差异表达的蛋白质,且在STEMI、NSTEMI、Control三组之间比较存在24种共同差异表达的蛋白质。通过Elisa法验证了SAA1在血清中表达水平与蛋白质组学的结果一致,且SAA1水平升高是AMI发生的独立危险因素,可作为诊断AMI发生的生物学标志物;2)在发生急性心肌缺血再灌注时,可使血清SAA1水平升高以及加重心肌组织的炎性损伤;3)SAA1可以通过激活NLRP3炎性小体从而促进心肌细胞缺氧/复氧后的细胞焦亡发生。