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目的:先天性梗阻性肾病是儿童慢性肾脏疾病的主要病因。超过50%的儿童慢性肾脏疾病为先天性肾脏和尿路畸形,其中大多数患儿伴有尿路梗阻。梗阻性肾病肾损伤原因复杂,尿路梗阻还常常合并肾发育异常。尽管临床上可以通过手术切除梗阻段,重建肾盂输尿管,但是仍然有部分患儿术后肾脏损伤无法恢复、甚至进展,导致远期肾脏功能恶化,最终需要血液透析和肾移植。这些问题提示梗阻的解除可能不足以逆转肾间质纤维化的进程。因此,寻找梗阻性肾病早期肾脏损伤的关键分子机制,早期干预肾间质纤维化的进展,挽救肾脏功能,具有重要的经济和社会意义。我们前期研究表明,能量代谢关键传感器-氧化应激传感器组蛋白脱乙酰酶（Sirtuin type 1,SIRT1）是肾脏发生上皮间充质转化、凋亡的关键蛋白。我们还进一步证实了SIRT1在发生EMT的体外培养的肾小管上皮细胞、新生鼠输尿管部分梗阻（Partial unilateral ureteral obstruction,PUUO）及大鼠输尿管完全梗阻（Complete unilateral ureteral obstruction,CUUO）动物模型中SIRT1在PUUO模型早期纤维化进程中起到促进纤维化的作用,SIRT1干扰载体通过调节Smad3通路延缓肾小管上皮细胞纤维化的进展。但是SIRT1又是如何被调控的,目前还不清楚,进一步深入研究SIRT1上游调控机制有助于寻找早期治疗梗阻性肾病肾损伤的新靶点。我们对手术治疗的肾盂输尿管交界处梗阻的肾积水患儿肾实质标本进行全基因组测序,比较分肾功能小于30%和分肾功能大于40%两组,miR-181d-5p和circ-0045861的表达具有明显差异。采用Targetscan及microRNA.org预测发现SIRT1与miR-181d-5p存在结合位点,同时采用circnet预测位于TNRC6C的circ-0045861与miR-181d-5p存在结合位点。我们进一步行q RT-PCR验证了miR-181d-5p和SIRT1在对照组、UUO术后2天和术后5天大鼠输尿管部分梗阻肾脏中的表达,UUO组miR-181d-5p在肾组织中表达下调,并随肾脏纤维化程度的加重表达逐渐降低,而SIRT1的表达随着肾纤维化程度的加重逐渐上升,提示miR-181d-5p与SIRT1二者的表达存在相关性。因此,我们提出新的假设,circ-0045861可能通过竞争性结合与3’UTR相结合的miRNAs,抑制miR-181d-5p的作用,从而上调SIRT1mRNA的转录,最终导致SIRT1蛋白表达异常,加强了SIRT1参与FOXO1对p53信号通路的调控,最终导致了梗阻性肾病肾脏损伤的发生发展。构建circRNA-miRNA-mRNA多维调控网络,有望首次清楚地了解circRNA,microRNA与SIRT1信号通路表达之间的关系,以及与梗阻性肾病肾脏纤维化发生发展的关系,并从RNA甲基化修饰的角度从转录水平深入理解疾病的发生机制,为早期诊断和治疗梗阻性肾病提供新思路,并为其它慢性肾脏疾病的发生发展机制提供新的线索,为早期诊断和治疗这些疾病提供新的靶点。研究方法:1、对肾盂输尿管梗阻性肾病（ureteropelvic junction obstruction）患儿行肾动态显像以检测分肾功能,将UPJO患儿分为分肾功能大于40%组,分肾功能小于30%组进行全基因组测序,并对结果进行分析,筛选出差异明显的circRNA及microRNA。体内体外实验验证circ-0045861、mir-181d-5p、SIRT1等细胞因子指标表达量。体外培养肾小管上皮细胞,通过TGF-β1诱导的EMT及H202诱导氧化应激,检测肾小管上皮细胞mir-181d-5p、circ-0045861和SIRT1的表达水平。选取新生鼠,制作输尿管单侧梗阻模型,体内检测UUO术后miR-181d-5p、circ-0045861与SIRT1的表达水平。2、通过体内、体外实验,干扰或过表达circ-0045861及miR-181d-5p,探讨circ-0045861/miR-181d-5p对SIRT1参与早期肾损伤的调控机制。细胞水平调控circ-0045861/miR-181d-5p后检测肾小管上皮细胞发生EMT、纤维化、凋亡及SIRT1/PI3K/AKT/FOXO1氧化应激通路的改变。体外培养肾小管上皮细胞,通过机械应力或TGF-β1促使细胞发生上皮间充质转化（EMT）,通过H2O2诱导细胞发生氧化应激。将细胞分为正常组、纤维化组、氧化应激三组,向三组分别加入circ-0045861或mir-181d-5p的抑制剂或模拟物,体外培养肾小管上皮细胞,构建mir-181d-5p与SIRT1的3’-UTR相结合的基因质粒、circ-0045861与SIRT1的3’-UTR相结合的基因质粒、circ-0045861与miR-181d-5p相结合的基因质粒以及其分别的突变型结合位点质粒。在肾小管上皮细胞中共转染miR-181d-5p或circ-0045861的抑制剂/扩增剂和报告基因,检测荧光素酶报道基因的活性,验证circ-0141134/miR-181d-5p/SIRT1mRNA是否存在结合位点。荧光原位杂交定位circ-0045861和miR-181d-5p的表达,检测上调或下调circ-0045861或miR-181d-5p对肾小管上皮细胞EMT、凋亡、纤维化、氧化应激、SIRT1/PI3K/AKT/FOXO1信号通路相关基因及蛋白质表达的影响。3、制作新生鼠输尿管梗阻动物模型,检测上调或下调circ-0045861或miR-181d-5p对输尿管梗阻后肾脏EMT、纤维化、凋亡及SIRT1氧化应激通路的影响。前期研究观察到新生鼠输尿管梗阻后2天出现足细胞转化,5天出现肾小管上皮细胞转化,因此分别于输尿管梗阻后1天、2天、3天和5天肾实质注射或经鼠尾静脉注射circ-0045861或miR-181d-5p的模拟物或抑制剂,检测输尿管梗阻前及梗阻后不同时间点circ-0045861/miR-181d-5p的表达,细胞凋亡、EMT、纤维化相关基因及蛋白质,SIRT1及PI3K/AKT/FOXO1信号通路相关基因及蛋白质表达的动态变化。4、通过建立小鼠输尿管梗阻模型,使用m6A测序分析结合RNA-seq,分析m6A修饰调控的分子蛋白、RNA,同时检测甲基化修饰酶METTL3,去甲基化修饰酶FTO,ALKBH5的表达,明确m6A修饰的调控机制,深入了解梗阻性肾病的发生发展机制。5、统计分析:Real-time PCR数据用2-△△Ct值表示,Western blot分析用Image J软件测量,使用相对密度展示结果,所有的实验数据均以均值±标准差来表示,应用SPSS19.0统计软件对于服从正态分布的数据实验组与对照组间比较采用两样本的t检验,对于不服从正态分布的数据,实验组组间比较采用Mann-Whitney U检验,p<0.05认为有统计学差异。结果:我们对分肾功能大于等于40%组和分肾功能小于30%组的UPJO患儿进行全基因组测序发现circRNA-0045861和miR-181d-5p的表达存在差异。HK-2细胞系中加入TGF-β1以诱导细胞纤维化,发现纤维化HK-2细胞中circ-0045861和SIRT1表达上调,miR-181d-5p表达下降。我们设计了circ-0045861的siRNA和miR-181d-5p的模拟物。向HK-2细胞中加入si-circ-0045861可以通过过表达miR-181d-5p抑制纤维化HK-2细胞的凋亡及纤维化。并通过双荧光素酶实验验证circ-0045861可与miR-181d-5p结合,fish实验证明circ-0045861和mir-181d-5p可共同定位于HK-2细胞质中。此外,我们进一步双荧光素酶实验证明,miR-181d-5p和SIRT1mRNA存在结合位点,在UUO动物模型和纤维化HK-2细胞模型,miR-181d-5p表达降低,SIRT1表达上升。我们构建了miR-181d-5p的模拟物,将模拟物转染入UUO模型和纤维化HK-2细胞中,发现miR-181d-5p mimics可以抑制UUO模型和纤维化HK-2细胞中的凋亡相关蛋白（p53,JNK,bax,caspase-9）和纤维化相关蛋白（α-sma,vim）的表达,并抑制了氧化应激相关蛋白（3-NT,Trx,p53）的的表达。梗阻性肾病中肾脏功能的下降受到RNA的m6A甲基化修饰调控,梗阻性肾病的病程进展与代谢过程,细胞过程的调节,细胞过程紧密等功能相关。而轴突接收信号通路、Gn RH信号通路与梗阻性肾病的肾脏功能的下降。其中,lncRNA ENSMUST00000149811.2,ENSMUST00000209614.在UUO模型中受到m6A甲基化修饰调控。结论:我们通过对分肾功能大于40%及分肾功能小于30%的UPJO患儿的肾脏组织进行全基因组测序,发现梗阻性肾病病程进展与细胞平衡代谢、单细胞生物进程、细胞外基质累积等生物代谢过程紧密相关,而梗阻性肾病肾脏功能的下降过程中,细胞粘附性信号通路和内质网蛋白形成信号通路的相关蛋白发生了改变,参与了肾脏功能下降的过程,而其中hsa＿circ＿0006577、hsa＿circ＿0045861与UPJO患儿的肾脏组织的肾脏纤维化关系密切,值得进行深入的研究。Circ-0045861在肾小管上皮细胞间质化过程中起重要调控作用,抑制circ-0045861可以抑制肾小管上皮细胞的纤维化及凋亡。miR-181d-5p在肾小管上皮细胞上皮间充质转化中表达下降,过表达miR-181d-5p可以抑制肾小管上皮细胞的纤维化及凋亡。而circ-0045861和miR-181d-5p,miR-181d-5p与SIRT1mRNA均存在结合位点。在梗阻性肾病的发病机制中circ-0045861作为ceRNA与miR-181d-5p结合以调控SIRT1的表达,进一步调节梗阻性肾病中氧化应激诱导的凋亡及纤维化。通过本研究发现,梗阻性肾病中肾脏功能的下降受到RNA的m6A甲基化修饰调控,其中m6A参与梗阻性肾病的多项病程进展,是病情发展的关键。