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前言肺癌是一种人类最常见的致死性癌症,在众多癌症中发病率和死亡率最高。由于肺癌的病因和转移倾向复杂,对人类的健康有很大威胁。从病理特征角度来看,肺癌可划分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌两个类型,非小细胞肺癌进一步分为鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌。其中最常见的是肺腺癌,约占所有肺癌的40%。虽然肺腺癌在治疗方法方面取得了许多进步,但肺腺癌仍然是最具攻击性和致命性的肿瘤类型之一,总生存率不到5年。由此可见,开发新的靶向基因疗法并将其应用到临床中,对于提高肺腺癌的临床治疗具有很重要的意义。吸烟是肺癌主要的环境危险因素,许多基因也已被报道参与肺腺癌的发生。据已有报道显示,ATP结合盒转运子E1(ATP-binding cassette transporter E1,ABCE1)是非小细胞肺癌的相关基因,并且其表达与非小细胞肺癌的临床分期有关。作为ABC转运子家族的成员,ABCE1主要表达在细胞质。核糖核酸酶L(Ribonuclease L,RNase L)抑制因子的蛋白能够被ABCE1基因编码,由于RNase L能在细胞内与RNA结合并降解RNA,因此RNase L抑制因子通过调控2-5腺苷酸/核糖核酸酶L(2-5A/RNase L)通路达到抑制RNA降解和抑制细胞凋亡的目的。目前已经确认,高表达的ABCE1有利于肿瘤细胞的生长和侵袭,而沉默ABCE1蛋白的表达可以减弱肿瘤细胞的活力和增殖能力,这表明ABCE1对肺腺癌转移的进展至关重要。因此,研究ABCE1可能对揭示人类恶性肿瘤发展的分子机制起到重要的作用。通过相关流行病学调查和临床研究表明,炎症与肿瘤的发生之间存在很强的联系。炎症反应贯穿于肿瘤变化的各个阶段,并在其中起到相当重要的作用。目前发现吸烟和环境污染物能够损伤支气管上皮细胞DNA并诱发炎症,随之促进肺癌的形成。核因子κB(Nuclear factor kappa light chain enhancer of B cells,NF-κB)是核内调控基因表达的转录因子,也是炎症因子、趋化因子等产生的关键调控因子,参与调节200多个基因的表达。NF-κB是免疫系统、骨骼系统以及上皮细胞发育必不可少的调控因子。研究表明在恶性肿瘤内NF-κB被激活,激活的NF-κB通过驱动增殖和上调抗凋亡蛋白的转录而致肿瘤存活。早期肺腺癌发现NF-κB信号通路的激活加重炎症并促进肿瘤细胞的产生。综上所述,我们提出NF-κB可能通过调控ABCE1的表达参与肺腺癌侵袭转移。我们拟以肺腺癌组织、肺癌细胞系及稳转细胞系裸鼠移植为基础,观察ABCE1与NF-κB p65、p50在肺腺癌组织、细胞以及瘤体中的表达情况,并沉默ABCE1后检测RNase L的表达以及研究肺癌细胞的增殖、侵袭、凋亡及动物致瘤性情况,深入研究ABCE1启动子活性并探索NF-κB的结合位点,从而探讨NF-κB对ABCE1的调控作用。材料与方法一、实验材料:1、48例人肺腺癌及相应癌旁肺组织标本2、人肺腺癌细胞系A549和肺癌细胞系95-D(人高转移性肺癌细胞)3、4-5周(14-17g)的Balb/c裸雌鼠4、Real-time PCR相关试剂5、免疫组化相关试剂6、免疫印迹相关试剂7、CCK8相关试剂8、Transwell相关试剂9、流式细胞术相关试剂10、动物致瘤测定相关工具11、质粒构建相关试剂12、荧光素酶报告基因检测相关试剂13、Ch IP(染色质免疫沉淀)相关试剂二、实验方法:1、收集肺腺癌及相应癌旁组织标本48例,同时对A549细胞和95-D细胞进行培养。2、Western Blot检测48例肺腺癌及癌旁标本中ABCE1的蛋白表达水平。3、Western Blot检测A549细胞和95-D细胞中ABCE1的蛋白表达水平。4、Real-time PCR检测48例肺腺癌及癌旁标本中ABCE1的m RNA表达水平。5、Real-time PCR检测A549细胞和95-D细胞中ABCE1的m RNA表达水平。6、利用sh RNA表达系统在A549细胞中构建沉默ABCE1表达A549-sh ABCE1细胞系。7、Western Blot检测A549-sh ABCE1细胞中ABCE1的蛋白表达水平。8、CCK8检测A549-sh ABCE1细胞和A549-p LKO.1细胞的增殖能力。9、Transwell检测A549-sh ABCE1细胞和A549-p LKO.1细胞的侵袭能力。10、流式细胞术检测A549-sh ABCE1细胞和A549-p LKO.1细胞的凋亡。11、将A549-p LKO.1细胞和A549-sh ABCE1细胞分别注入裸鼠腋窝,构建裸鼠移植模型,第21天对裸鼠进行颈椎脱位,检测致瘤性。12、Western Blot检测瘤体ABCE1和RNase L的表达。13、Real-time PCR检测瘤体ABCE1和RNase L的表达。14、Western Blot检测肺腺癌、癌旁组织和肺癌细胞中NF-κB p65、p50的表达。15、免疫组织化学检测肺腺癌及癌旁组织NF-κB p65、p50的蛋白表达定位。16、载体构建及荧光素酶报告基因检测95-D和A549细胞中ABCE1系列启动子及突变NF-κB结合位点活性。17、Ch IP检测95-D和A549细胞中NF-κB p50和p65与ABCE1上游启动子预测位点的结合情况。结果1、肺腺癌组织中ABCE1的表达水平较癌旁肺组织明显增高,并且ABCE1在肺腺癌A549细胞中高表达。Real-time PCR和Western Blot结果一致。2、CCK8结果显示,相比对照组细胞A549-p LKO.1,沉默ABCE1基因后,A549-sh ABCE1细胞增殖能力显著性下降。3、细胞侵袭结果显示,相比对照组细胞A549-p LKO.1,沉默ABCE1基因后,A549-sh ABCE1细胞的侵袭能力显著降低。4、流式细胞术结果显示,相比对照组细胞A549-p LKO.1,沉默ABCE1基因后,A549-sh ABCE1细胞凋亡率增加。5、在裸鼠移植模型中,A549-sh ABCE1细胞组肿瘤体积明显小于A549-p LKO.1细胞组。6、Western Blot结果显示p65和p50在肺腺癌组织和细胞系中均有高表达;在A549-sh ABCE1细胞组瘤体中,ABCE1表达下调,RNase L表达升高。7、免疫组化结果显示p65、p50在肺腺癌及癌旁组织细胞核中有聚集。8、Western Blot和Real-time PCR结果显示与95-D相比,p65、p50在肺腺癌A549细胞中高表达,ABCE1表达增加,RNase L的表达下降。9、荧光素酶检测表明,p GL3-488和p GL3-110具有几乎相同的启动子活性,而p GL3-47的ABCE1启动子活性明显低于p GL3-110中,表明ABCE1启动子(-110-47)区域存在正调控区,并且该区有预测NF-κB的结合位点。p GL3-mut启动子活性也明显低于p GL3-110,说明突变NF-κB结合位点后,启动子正调控活性丧失。10、Ch IP测定表明,在95-D和A549细胞中,p65和p50能够与ABCE1上游(-110-47)区预测的NF-κB结合位点结合。并且p65和p50与NF-κB预测位点结合活性在A549细胞系中显著增加。结论1、ABCE1在肺腺癌及肺腺癌细胞系A549中高表达。2、沉默ABCE1表达的细胞系A549增殖能力和侵袭力下降,凋亡率上升。3、沉默ABCE1表达的细胞系A549动物致瘤率和体积下降。4、NF-κB p65、p50在肺腺癌及肺腺癌细胞系中高表达。5、高表达的NF-κB上调肺腺癌中ABCE1的表达。