腐败希瓦氏菌致腐相关基因分析及群体感应信号分子对其调控作用的研究

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大黄鱼营养丰富、蛋白质及水分含量较高,是我国主要的出口水产品,也是我国东南部一种重要的经济海洋鱼类,随着人们对大黄鱼的需求越来越高,大黄鱼的养殖产业也发展迅速,上世纪90年代中后期,我国农业部将大黄鱼确定为优势出口水产品之一。然而,也正是由于大黄鱼的营养价值较高,特别是蛋白质含量丰富,使大黄鱼在贮藏过程中极易腐败变质,其主要原因是蛋白质在一般条件下易被微生物分解,同时,鱼体在死亡之后由于自身的一些蛋白酶作用,也易降解蛋白质从而使其腐败,进而使其营养价值降低。水产品发生腐败变质的主要因素是微生物的活动。有研究表明,在大黄鱼的捕捞、运输、贮藏过程中,使其发生腐败变质的为一些特定腐败菌(specific spoilage organisms, SSOs),而对于大黄鱼这种海产鱼来说,在低温贮藏条件下其主要的特定腐败菌多为假单胞菌属(Pseudomonas spp.)或希瓦氏菌属(Shewanella spp.)。群体感应信号分子DKPs是新发现的一种种间信号分子,研究表明,群体感应信号分子能够调控某些基因的表达从而使食品发生腐败。目前,对于抑制水产品腐败的研究主要集中在采用特定的抑制剂或一些保鲜措施上,而对于群体感应信号分子DKPs对于不同腐败菌致腐的调控作用还鲜有报道,因此,本文的研究目的是探究不同希瓦氏菌株的致腐差异和群体感应信号分子DKPs对于致腐差异希瓦氏菌株的调节作用,并从基因水平上对差异原因进行阐释究。研究得到的结果如下:第一,添加四种信号分子DKPs (cyclo-(L-Leu-L-Leu)、 cyclo-(L-Pro-L-Gly)、cyclo-(L-Pro-L-Leu)和cyclo-(L-Pro-L-Phe))后,最强和最弱的希瓦氏菌株Shewanella baltica的生长均增强,且四种信号分子对两菌株生长曲线的调控作用不同,对于腐败性最强的希瓦氏菌株S. baltica OS 185来说,信号分子cyclo-(L-Pro-L-Phe)明显促进了该菌的生长;而对于希瓦氏菌株S. baltica OS223来说,信号分子cyclo-(L-Pro-L-Leu)的促进作用较为明显;培养不同时间段时检测添加信号分子前后生物被膜的形成情况,发现生物被膜的形成量在0-96 h期间,呈现先上升后下降的趋势,且添加信号分子后,生物被膜形成量均高于对照组。第二,16株不同的希瓦氏菌株致腐差异的比较,通过相关腐败指标:菌落总数、感官测定、三甲胺(TMA)测定、挥发性盐基氮(TVB-N)测定、生物胺等的测定发现,希瓦氏菌株S. baltica 074、 S. baltica 081、S. baltica 075、S. baltica 072、S. baltica 071、S. baltica 077、S.baltica 098、S.baltica 073、S.baltica 100的腐败性明显高于其他菌株,其中希瓦氏菌株S. baltica 073、S.baltica 100的腐败性最强,而希瓦氏菌株S. baltica 034腐败最弱;在此基础上,对不同希瓦氏菌株全基因进行测序,发现不同希瓦氏菌株的氧化三甲胺还原酶基因-TorT基因在氨基酸及核酸上也是有差异的,通过Blast对比,发现希瓦氏菌株S. baltica 077、S. baltica 098、S. baltica 073的氨基酸序列与S. baltica OS 185的同源性达100%,希瓦氏菌株S. baltica 074、S. baltica 081、S. baltica 075、S. baltica 072、S. baltica 071的氨基酸同源性达93%以上,而其余菌株的氨基酸序列同源性仅有23%左右;通过将全基因与腐败表型进行拟合发现,两者的拟合性较好,R均在0.8左右,这就进一步印证了基因差异与腐败有一定的关系,为进一步从基因方面探讨腐败机制提供了依据。第三,不同的群体感应信号分子DKPs添加后,两菌株(最强和最弱)中氧化三甲胺还原酶基因、半胱氨酸合成酶B基因、硫氧还原蛋白还原酶基因mRNA表达量均有所变化,四种信号分子DKPs对于氧化三甲胺还原酶基因、硫氧还原蛋白还原酶基因具有正调控作用,而对于半胱氨酸合成酶B基因具有负调控作用。
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