2020年版《中国药典》记载,九里香来源于芸香科九里香属植物九里香Murraya exotica L.和千里香M.paniculata（L.）Jack.的干燥叶和带叶嫩枝。九里香具有行气止痛、活血散瘀的功效,常用于治疗胃痛、风湿痹痛、牙痛。中药九里香也是中成药“三九胃泰”的主药之一,用量很大。九里香药材两基原植物的分类地位一直存在争议,进行过多次变更。国外多数学者基于形态学上中间体的存在,认为九里香M exotica和千里香M.paniculata应为同一物种,但国内当前仍分别保留九里香M.exotica和千里香M paniculata种的等级。研究表明,九里香和千里香的化学成分具有较大差异,九里香叶的主要成分为香豆素类,而千里香的为多甲氧基黄酮类。当前市场中的九里香药材主要来源于千里香,九里香更常作为南方地区的绿化植物使用。因此为了保障九里香药材用药安全有效,厘清九里香和千里香的亲缘关系,并开发二者的分子鉴别标记是很有必要的。本研究首先收集了 69份不同区县九里香和千里香标本,并对其进行基于叶片性状特征的数量分类学研究;进一步对8种九里香属植物的叶绿体基因组进行比较分析,并基于叶绿体基因组筛选获得九里香和千里香鉴别的DNA序列特征性片段（DNA Signature Sequence,DSS）;在此基础上,根据DSS标记的SNP位点设计特异性鉴别引物,建立中药九里香两基原多重位点特异性PCR鉴别方法。本研究的主要内容及结果如下:1.基于九里香和千里香的性状差异,选择了 8个叶片性状特征对69个九里香、千里香样本进行数量分类学研究,性状特征包括小叶最宽处、叶形、叶端、叶尖微凹情况、叶缘、小叶数、小叶长、小叶宽。R型聚类结果表明,小叶长和小叶宽具有较高相关性;主成分分析结果可知,小叶最宽处、叶形、叶端、小叶宽对九里香和千里香的分类影响较大,可作为二者分类的重要指标。Q型聚类树状图显示,总样本可分为九里香和千里香两大类,表明在叶片性状上九里香与千里香具有明显差异。2.分别测序并组装了九里香M exotica、千里香M.paniculata、翼叶九里香M.alatta、豆叶九里香M.euchrestifolia、广西九里香M.kwangsiensis、大叶九里香M.kwangsiensis var.macrophylla、小叶九里香M microphylla的叶绿体基因组,从Genbank数据库下载的调料九里香M.koenigii叶绿体基因组,并对8种共33个样本的九里香属植物叶绿体基因组进行注释。结果表明,九里香属物种叶绿体基因组较为保守,呈经典四分体结构,由两个单拷贝区及两个反向重复区组成。九里香属叶绿体基因组长度在158,573～160,817 bp之间,平均为160,169 bp;GC含量在38.54-38.65%之间,平均为38.62%;共含112个不重复基因,其中包括78个蛋白编码基因,30个tRNA基因以及4个rRNA基因;共获得1233条重复序列,7924条SSR。3.IR边界分析结果表明,8种九里香属叶绿体基因组存在IR区域的扩张和收缩,其中九里香出现IR区扩张,而大叶九里香出现IR区收缩。基因组比对和共线性分析结果表明,8种九里香属植物的叶绿体基因组序列具有高度相似性,且未出现明显结构重排。基于叶绿体全基因组、编码序列（coding sequence,CDS）、非编码序列（non-coding sequence,NCS）3个数据集,分别使用最大似然法（maximum likehood,ML）和贝叶斯法（Bayesian inference,BI）构建九里香属的系统发育树,结果表明6个系统发育树具有一致的拓扑结构,且各个进化分支均具有较高的支持率。九里香组的九里香、千里香和翼叶九里香聚为一支,其中九里香与翼叶九里香具有更紧密的亲缘关系。上述结果支持将九里香、千里香列为2个独立的物种。4.使用IdenDSS软件对九里香属叶绿体基因组进行分析,筛选并验证可用于九里香和千里香鉴定的DSS分子标记。在此基础上,筛选出九里香和千里香的SNP鉴别位点,并设计特异性鉴别引物,建立九里香药材两基原的多重位点特异性PCR鉴别方法,进行方法耐受性和适用性考察。在该多重位点特异性PCR鉴别方法中,九里香样本可获得约330 bp的特异性条带,千里香样本可得到约230 bp的特异性条带,通过一次PCR反应即可完成九里香、千里香的鉴别。