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目前,肺癌(Lung Cancer,LC)是世界上发病率最高且死亡率最高的一种恶性肿瘤,在全世界范围内其发病人数仍呈持续的上升趋势。传统的疗法如手术切除、放射治疗、化学治疗和单抗治疗等,仅适合少数早期患者,虽有一定的治疗效果,但难以完全治愈,且副作用大,极易复发。随着基因工程在生物和医学领域的广泛应用,使基因靶向疗法用于癌症的治疗成为可能。基因疗法表现出越来越突出的优势,尤其以腺病毒为载体靶向癌细胞的疗法受到广泛的关注,将成为研究的热点,有望代替传统疗法用于癌症的治疗。用免疫缺陷动物(如BALB/c裸鼠)建立肿瘤模型是研究溶瘤腺病毒抗肿瘤作用的重要工具,但传统的动物模型无法连续地、动态地研究肿瘤的生长和转移、以及溶瘤腺病毒的抑瘤作用。荧光素酶基因(luciferase gene)作为常用报告基因之一,具有内源性低、稳定性好和灵敏度高等特点,广泛地用于标记各种类型的肿瘤细胞;并建立通过活体成像系统观察的肿瘤模型,能够非侵入性地、实时地、连续地监控肿瘤生长和转移;即使治疗过程中肿瘤细胞的细微变化也能及时地检测到,为进一步在整体水平上研究溶瘤腺病毒的抑瘤效果提供了理想的动物模型。本课题组构建的重组腺病毒(Ad-VT、Ad-T、Ad-VP3和Ad-Mock)采用的是RAPAd.I包装系统,Ad-VT(Ad-Apoptin-hTERTp-E1A)是由肿瘤特异性启动子(hTERTp,人端粒酶逆转录酶)启动E1A基因(病毒复制必需基因)、巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)启动子启动凋亡素基因(Apoptin),因此Ad-VT既具有肿瘤特异性杀伤和肿瘤特异性复制能力的双特异性溶瘤腺病毒;对照病毒Ad-T(Ad-hTERTp-E1A)、Ad-VP3(Ad-CMV-Apoptin)和Ad-Mock。研究目的:本研究通过建立荧光素酶标记人肺癌细胞A549-luc和BALB/c裸鼠皮下荷瘤模型,来探讨溶瘤腺病毒Ad-VT对A549-luc细胞的抑制作用。研究内容:1.筛选稳定表达荧光素酶人肺癌细胞A549-luc,并进行了荧光素酶活性及稳定性、体外成像和生物学特性的检测;2.溶瘤腺病毒Ad-VT对荧光素酶标记人肺癌细胞的体外抑制作用研究;3.溶瘤腺病毒Ad-VT对荧光素酶标记人肺癌细胞的体内抑制作用研究。研究方法:1.荧光素酶标记人肺癌细胞的构建与鉴定通过质粒转染与G418加压筛选、荧光素酶活性及稳定性和体外成像等方法筛选出稳定表达荧光素酶的人肺癌细胞,并进行了A549-luc细胞和A549细胞的生长特性、迁移和侵袭能力及细胞周期等生物学特性的检测。2.溶瘤腺病毒Ad-VT对荧光素酶标记人肺癌细胞的体外抑制作用研究通过结晶紫染色和WST-1研究Ad-VT对A549-luc细胞和A549细胞的杀伤作用,并从线粒体膜电位(JC-1染色)、细胞核(Hoechst染色)和细胞膜(AnnexinV-FITC/PI染色)等的形态学变化验证Ad-VT对A549-luc细胞和A549细胞的杀伤途径,再通过划痕实验、Transwell小室迁移和BioCoat小室侵袭等研究Ad-VT对A549-luc细胞和A549细胞的迁移和侵袭能力影响。3.溶瘤腺病毒Ad-VT对荧光素酶标记人肺癌细胞的体内抑制作用研究通过对BALB/c裸鼠的右后肢近背部区域皮下接种A549-luc细胞,成功建立皮下荷瘤模型后,随机分成六组;从0W开始,用活体成像系统每周拍照一次,并用游标卡尺测量肿瘤大小,连续测定6W~7W;2W后用重组腺病毒开始治疗,连续治疗4W,研究溶瘤腺病毒Ad-VT对肿瘤的抑制效果和小鼠生存期的影响。研究结果:1.通过质粒转染与G418加压筛选、荧光素酶活性及稳定性检测,获得一株活性最高且稳定性最好的Clone28;通过体外成像实验,验证了Clone28的细胞数目与其发光强度呈正相关的线性关系,R2=0.9948;通过A549-luc细胞和A549细胞生物学特性鉴定,证明了构建过程对细胞的生长特性、迁移和侵袭能力以及细胞周期未产生显著的影响。2.通过结晶紫染色和WST-1检测,证实了Ad-VT对A549-luc细胞和A549细胞的杀伤作用无显著差异,且具有显著时间效应和剂量效应,而重组腺病毒对细胞抑制率依次为:Ad-VT>Ad-T>Ad-VP3>Ad-Mock;通过JC-1染色、Hoechst染色和Annexin V-FITC/PI染色实验,表明Ad-VT对A549-luc细胞和A549细胞的杀伤途径无显著差异,且Ad-VT主要通过诱导凋亡(如线粒体膜电位的变化、核碎裂、核浓染和磷酯酰丝氨酸翻转等典型形态学特征)发挥杀伤作用,而重组腺病毒诱导凋亡的能力依次为:Ad-VT>Ad-T>Ad-VP3>Ad-Mock;通过划痕实验、Transwell小室迁移和BioCoat小室侵袭,表明Ad-VT对A549-luc细胞和A549细胞的迁移和侵袭能力影响无显著差异,且具有显著时间效应和剂量效应,而重组腺病毒抑制迁移和侵袭能力依次为:Ad-VT>Ad-T>Ad-VP3>Ad-Mock。3.通过对BALB/c裸鼠右后肢近背部皮下接种A549-luc细胞后,成功地建立了裸鼠皮下荷瘤模型;0W~3W时,Ad-VT治疗组肿瘤的平均生物发光强度、平均肿瘤体积与其他治疗组无明显差异;3W~5W时,Ad-VT治疗组的平均生物发光强度、平均肿瘤生长速度与对照组相比,显著降低,而平均肿瘤抑制率显著增大;肿瘤体积与其生物发光强度之间呈一定的正相关的线性关系,生物发光强度随着肿瘤体积的增加而增强;Ad-VT治疗组小鼠的平均生存期显著延长。研究结论:1.成功构建了稳定表达荧光素酶的人肺癌细胞A549-luc,并验证了A549-luc细胞和A549细胞的生物学特性无显著差异。2.溶瘤腺病毒Ad-VT对荧光素酶标记人肺癌细胞A549-luc具有显著杀伤作用,主要通过诱导细胞凋亡发挥杀伤作用,并能有效减弱A549-luc细胞的迁移和侵袭能力。3.成功建立了BALB/c裸鼠皮下荷瘤模型,借助活体成像系统能够在活体内实时地监控肿瘤生物发光强度和体积变化;溶瘤腺病毒Ad-VT具有显著抑瘤效果,并延长小鼠平均生存期。