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日本乙型脑炎是由日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)感染引起的神经性疾病。该病主要分布在南亚和东南亚地区,现已成为该地区主要流行的病毒性脑炎。根据世界卫生组织的统计数据,JEV感染每年可导致约10000-15000人死亡。但并不是所有的JEV感染都能够引起发病,仅有少数(大约1:300)感染的个体表现脑炎的症状。因此,这些脑炎的病例说明,在从外周扩散入脑的过程中,JEV可通过某种机制逃逸宿主的免疫监视。已有的研究显示,外周血单核细胞包括巨噬细胞及其前体细胞在这个过程中发挥一定的作用,表现为:1)可以从外周单核细胞中分离获得JEV;2)JEV可以在巨噬细胞中存活。所以,从某种意义上讲,JEV与巨噬细胞相互作用很可能会影响JE的发生。巨噬细胞是机体的主要免疫细胞,在宿主的先天性免疫和获得性免疫反应中都起着重要的作用。其生物学功能因激活状态不同而受到影响,目前,巨噬细胞根据激活状态主要分为M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞,前者主要由Th1型细胞因子如γ-干扰素(Interferon-γ,IFN-γ)等诱导产生,后者主要由Th2型细胞因子如IL-4(Interleukin-4)等诱导产生。体外的研究显示,相对于非免疫细胞如Vero细胞(Verda Reno,非洲绿猴肾细胞)、MEF(Mouse Embryonic Fibroblast,小鼠胚胎成纤维细胞)等,巨噬细胞显示出明显的抑制JEV作用。进一步研究发现,IFN-γ诱导的巨噬细胞可以通过促进一氧化氮(nitrogen monoxidum,NO)的产生抑制JEV的复制。但是,目前对M2型巨噬细胞是如何影响JEV感染的机制还不清楚。有趣的是,研究发现Th2免疫反应对JEV引起的脑炎具有保护作用。目的:为了阐明不同激活状态的巨噬细胞对JEV感染的影响,尤其是对JEV强毒株感染的影响,有以下2个研究目的,(1)明确JEV强毒株NJ2008在体内和体外的感染特性;(2)解析不同激活状态的巨噬细胞对JEV强毒株NJ2008感染的影响。方法:(1)为了明确JEV强毒株NJ2008在体内和体外的感染特性,首先,用C6/36细胞增殖NJ2008,并通过TCID50测定分析病毒滴度。其次,通过腹腔感染C57BL/6小鼠测定生存曲线。随后,利用TCID50测定、Western Blot以及间接免疫荧光法对JEV脑部感染情况进行分析。最后,对JEV强毒株NJ2008在体外的感染特性进行了分析,包括:1)利用TCID50测定分析比较了NJ2008在BHK-21和巨噬细胞RAW264.7上的一步生长曲线;2)利用间接免疫荧光法分析比较了NJ2008在以上两种细胞上的感染情况。(2)为了解析不同激活状态的巨噬细胞对JEV强毒株NJ2008感染的影响,首先,利用细胞因子(IL-4或IFN-γ)处理RAW264.7细胞,通过荧光定量PCR检测巨噬细胞激活的标志分子(i NOS和Arg-1)以及细胞因子(CXCL-10和TNF-α)的变化情况,确定巨噬细胞的激活状态;然后通过TCID50、免疫荧光技术和荧光定量PCR方法比较JEV强毒株NJ2008在不同激活状态的巨噬细胞上的感染情况。结果:(1)JEV强毒株NJ2008在体内和体外的感染特性分析:首先,利用TCID50测定对增殖的病毒进行分析,计算获得病毒的滴度为8.3×108 TCID50/0.1 m L。其次,通过腹腔感染C57BL/6小鼠测定生存曲线,发现以8.3×104 TCID50/100μL/小鼠进行感染,于感染后7天到14天死亡率超过60%。随后,对发病小鼠脑的感染情况进行了分析,发现脑内的病毒滴度超过107 TCID50/脑,进一步,Western Blot以及间接免疫荧光法(IFA)分析显示脑内JEV感染阳性。最后,对JEV强毒株NJ2008在体外的感染特性进行了分析,一步生长曲线的结果显示于感染后24小时病毒的滴度达到高峰,然而,相对于BHK-21中的感染情况,JEV在RAW264.7中的感染显著降低,进一步的IFA检测结果显示JEV在BHK-21中的感染率明显高于在RAW264.7中的感染率。(2)不同激活状态的巨噬细胞对JEV强毒株NJ2008感染的影响:首先,通过荧光定量PCR检测,我们发现,相对于PBS处理组,IFN-γ处理组显著上调M1型巨噬细胞细胞标志分子i NOS,同时显著上调CXCL-10和TNF-α的表达,说明成功将巨噬细胞诱导为M1型巨噬细胞;另外,相对于PBS处理组,IL-4处理组显著上调M2型巨噬细胞细胞标志分子Arg-1,同时抑制炎性因子CXCL-10和TNF-α的表达,说明成功将巨噬细胞诱导为M2型巨噬细胞;其次,我们利用上述细胞对JEV感染情况进行了分析,虽然JEV在M2型巨噬细胞上的感染与PBS组没有明显的变化,但是,其在M1型巨噬细胞上的感染显著受到了抑制。因此,以上结果明确了不同激活状态的巨噬细胞对JEV感染的影响,并显示NO的上调表达在M1型巨噬细胞抑制JEV感染中起着主导作用。结论:我们的研究明确了M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞对JEV感染的作用。进一步研究显示,M1型巨噬细胞可显著地抑制JEV的感染,即通过促进NO的产生抑制JEV的复制。虽然M2型巨噬细胞在抑制JEV感染方面不如M1型巨噬细胞明显,但是,在JEV脑内感染中,Th2免疫反应对JEV脑内感染具有保护作用。M2型巨噬细胞在这个过程中是否发挥了重要作用,尚不清楚,这些疑问将在今后的研究中进行探讨。总之,我们的结果明确了不同激活状态的巨噬细胞对JEV感染的作用。该研究结果不仅丰富了JEV与巨噬细胞相互作用的知识,而且为将来进一步揭示巨噬细胞作为一种抗原提呈细胞在JEV感染中的作用奠定了良好的基础。