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鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitis,DVH)主要是由小RNA病毒科(Picornaviridae)禽肝病毒属(Avihepatovirus)的鸭甲肝病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV)所引起的一种病程短、高度致死的传染性疾病。该病主要危害一月龄以内的雏鸭,对养鸭业造成巨大的经济损失。3C蛋白酶是小RNA病毒科病毒重要的蛋白酶之一,在病毒的复制过程中起到不可替代的作用。本研究利用实验室构建的鸭甲肝病毒1型(Duck hepatitis A virus type 1,DHAV-1)DNA-Lanched传染性克隆,通过PCR点突变的方法对3C基因的第38位和144位氨基酸进行定点突变,以研究突变后病毒的增殖能力及部分生物学活性的变化。本研究共分为三部分:1、3C蛋白的原核表达及抗血清的制备为了进行DHAV-1传染性克隆的IFA鉴定,本研究制备抗3C血清,首先将野生型3C基因及38位氨基酸突变基因3C38,144位氨基酸突变基因3C144,以及38和144位氨基酸同时突变基因3C38+144四组基因分别克隆到原核表达载体pGEX6P-1中,将鉴定正确的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中经诱导剂IPTG诱导表达出融合蛋白。将纯化后的融合蛋白与弗氏完全佐剂混合,免疫BALB/C小鼠,每只小鼠100μg。间隔两周后,使用同一免蛋白量相同量的融合蛋白与弗氏不完全佐剂混合,进行二免、三免和加强免疫。加强免疫结束后7天,小鼠眼球取血,离心后得到四份抗血清,ELISA检测发现四组抗血清中3C38的血清效价最高。2、3C突变基因传染性克隆的构建参照实验室保存的DHAV-1传染性克隆的序列和酶切图谱设计引物,分别扩增3C38、3C144、3C38+144和2C3A片段,通过引物将3C38、3C144、3C38+144与2C3A片段用EX Taq酶分别进行PCR融合,得到2C3A3C38、2C3A3C144和2C3A3C38+144片段,并连接到pMD18-T载体上,酶切鉴定得到阳性质粒,利用T载体通用引物进行测序,结果分析表明除人工诱变的定点突变外,其余部分与母本病毒中的3C序列的同源性均为100%。参考DHAV-1传染性克隆的酶切图谱,设计引物,将突变后的2C3A3C基因定向装配到全基因组中。首先将得到的2C3A3C均与3D片段进行融合,得到2C3A3C3D(文中简称为CD)片段,利用全基因组中存在的EcoRV酶切位点,将其按顺序装配到全基因组中,获得阳性重组子SR38、SR144和SR38+144,测序后发现只有定点突变的3C基因中的第38位氨基酸和第144位氨基酸发生突变,其余的氨基酸均无突变。将重组质粒SR38、SR144和SR38+144转染BHK-21细胞,以母本SR质粒作为阳性对照,以无菌的PBS作阴性对照。转染后,BHK-21细胞未出现明显的CPE。将转染后的四组细胞反复冻融后再次感染细胞,用荧光定量PCR和IFA方法检测均为阳性。经基因测序鉴定,表明病毒拯救成功。3、拯救病毒的增殖能力与部分生物学活性的检测重组质粒转染BHK-21细胞后,在细胞培养箱中培养48h后,收集细胞毒。用收集到的SR38、SR144和SR38+144三组拯救病毒与母本病毒再感染BHK-21细胞,并测定24h、36h、48h、60h和72h五个时间点病毒的拷贝数,绘制各病毒的生长趋势图。病毒的生长趋势图表明3C基因不同突变点的拯救病毒的增殖周期是不同的,并且病毒的最大拷贝数也是不同的,说明3C基因中的第38位氨基酸和第144位氨基酸的突变对病毒的增殖造成了一定的影响。为了研究拯救病毒的生物活性的变化,本研究将65枚9日龄的健康鸭胚分成五组。其中第1组向尿囊液中接种300μL的无菌PBS,余下的2、3、4、5组分别接种同剂量的拯救病毒SR、SR38、SR144和SR38+144。按24h、48h、72h、96h和120h五个时间点观察不同组鸭胚的临床症状,并收集尿囊液,利用荧光定量PCR检测病毒在其中的增殖情况。结果表明拯救病毒与母本病毒增殖周期与病毒拷贝数均存在差异,但在胚体上均可以观察到肝脏和脑出血、胚体上也具有明显的出血点等临床症状。