流苏、金钗、报春石斛种子非共生萌发以及流苏石斛离体保存的研究

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流苏石斛(Dendrobium.fimbriatum Hook.)、金钗石斛(D.nobile Lindl.)和报春石斛(D.primulinum Lindl.)属于兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium),具有重要的观赏价值和药用价值。由于其自身生物学特性及人为破坏等因素,野生石斛资源濒临灭绝。本文通过对流苏石斛繁育系统的初探以及流苏石斛、金钗石斛和报春石斛种子非共生萌发的系统研究,为野生石斛的工厂化育苗提供了参考数据;同时在组织培养的基础上,结合离体保存技术对野生石斛种质资源保存可行性进行了研究,以期找到野生石斛种质资源最佳的中长期保存方法,对保护生物多样性的保护具有积极意义。本试验通过不同授粉方式,对流苏石斛繁育系统进行了研究,结果表明:流苏石斛既不存在无融合生殖也不存在自动自花授粉现象,它必须借助一定的传粉媒介来实现繁殖成功。流苏石斛自交部分不亲合,其自交结实率较低,仅为11.11%;异交结实率为76.47%,明显高于自交结实率。对3种野生石斛种子非共生萌发试验结果表明:培养温度20-30℃时,3种石斛种子均可萌发,但25℃下表现最佳,其种子萌发整齐,圆球茎粒大呈鲜绿色。培养条件为KnudsonC(KC)+2 mg/L6-BA+0.2 mg/LNAA时最利于流苏和金钗石斛原球茎诱导和幼苗分化,圆球茎诱导率分别为96.1%和97.3%,幼苗分化率分别为95.2%和95.7%;KC+0.5 mg/L NAA时最适报春石斛原球茎诱导和幼苗分化,诱导率和分化率分别为90.3%和81.3%。培养基中添加1 mg/LAC对3种石斛种子萌发影响不明显,种子前期萌发整齐,生长势好,但在圆球茎培养18-36d内出现死亡现象。对流苏石斛离体保存的研究,分为幼苗低温限制生长离体保存和圆球茎超低温保存两部分。幼苗低温限制生长离体保存:在15℃下,流苏石斛试管幼苗生长受到抑制,KC培养基+3%mannitol,10个月后存活率可达96%。存活的幼苗接种于增殖培养基中,仍能正常生长、增殖和生根。同时,KC培养基+1%mannitol,KC培养基+5%mannitol以及对照,试管幼苗10个月后存活率分别为68%,40%和28%;KC培养基+10-50mg/L B9,试管苗保存4个月后全数死亡;添加0.5 mg/L NAA+1 g/LAC的KC培养基中保存10个月后存活率为82%,效果较好;0.1 mg/L NAA+1g/LAC和1.0mg/L NAA+1g/LAC组合存活率分别为72%,40%。圆球茎超低温保存:液体KC培养基+10mg/L ABA,预处理10d后的流苏石斛原球茎,脱水速率低于对照,脱水10h后含水量由初始10.1329g H2Og-1DW降至0.2215g H2Og-1DW;对照含水量由初始11.0050g H2Og-1DW降至0.1735g H2Og-1DW。脱水10h后的存活率为62%,对照为57%。证明ABA预培养使原球茎获得了更高的脱水耐性。脱水耐性是由一系列的损伤和保护机制相互协调的复杂生理现象。脂质过氧化反应和活性氧压造成损伤的重要原因。在脱水过程中,ABA处理及对照组合的流苏石斛原球茎内CAT活性呈上升趋势;APX活性呈下降趋势;SOD活性则是先下降,在脱水6h时大幅上升后再下降;APX和SOD活性的降低在一定程度上被CAT活性的增加所补偿。脱水6h时,ABA处理的原球茎含水量为0.6250gH2Og-1DW,超低温保存后,存活率和恢复率分别为74%和72%;对照原球茎含水量为0.4837gH2Og-1DW,冻后的存活率和恢复率分别为81%和77%。结果表明:ABA对原球茎超低温保存的影响不明显,影响超低温保存结果的因素主要为含水量。适合流苏石斛原球茎超低温保存的含水量在0.4837-0.6250g H2Og-1DW之间。
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