论文部分内容阅读
昆虫抗冻蛋白具有较高的抗冻活性，生物体内微量的抗冻蛋白尤其是高活性的抗冻蛋白很难满足诸多方面应用。因此，探索出生产高活性抗冻蛋白的有效方法亟待解决。本研究基于此目的利用基因工程的技术和方法开展了抗冻蛋白基因的分子克隆、突变和表达工作。通过在引物上设计突变位点A和B，运用PCR技术扩增和克隆出了融合克隆载体pUCm-T-afp84a的突变体pLICm-T-afp84a-A和pUCm-T-afp84a-B。两个突变体与载体pMAL-c2X双酶切后连接，构建融合表达质粒pMAL-c2X-afp84a-A和pMAL-c2X-afp84a-B。2个表达质粒分别转化Ecoli TBI。经IPTG及最适条件诱导表达，目的蛋白表现为可溶性。超声波细胞破碎法使2种融合蛋白分别从含有融合表达质粒的细胞中释放。融合蛋白运用亲和层析和分子筛层析纯化后，SDS-PAGE显示目的蛋白呈单一条带；生物活性实验检测各自目的蛋白具有一定的抗冻活性。对比结果，突变后的抗冻蛋白都具有比突变前较高的抗冻活性，为进一步研究提高抗动蛋白活性摸索了一个有效的办法。