挑取黄粉甲末龄幼虫，放入铺有麦麸的培养皿中，在4℃条件下经过4周诱导后，提取脂肪体细胞的总RNA，然后通过RT-PCR克隆得到了编码120个氨基酸和84个氨基酸的3个黄粉甲抗冻蛋白cDNA序列，其中两个与前人已经发表的序列不同，120个氨基酸的cDNA与发表的序列有两个碱基的差别，引起两个氨基酸残基的变化，但都不是保守的Cys或者T-C-T基序的氨基酸；84个氨基酸的cDNA与发表的序列只有一个碱基不同，且在密码子的第三位，未引起编码氨基酸的变化，估计是一个同义突变。这两个序列已经提交GENBANK，登录号分别是DQ234275和DQ234274。运用内含肽介导的蛋白质表达系统，分别构建了pMXB10-afp120、pMXB10-afp84和pTWIN1-yl-4融合表达载体，通过IPTG诱导，融合蛋白都得到了表达。设计四因素四水平正交实验，优化表达条件。收集诱导表达的菌体，用过柱缓冲液重悬，冰上超声波破碎仪破碎细胞，离心后上清液过几丁质亲和柱，融合蛋白特异吸附在几丁质柱上。用过柱缓冲液洗去非特异吸附的杂蛋白，然后用诱裂解缓冲液平衡柱子，在诱裂解缓冲液作用下，分别在4℃或者25℃放置16-40h，释放出目的蛋白。最后用缓冲液洗脱目的蛋白，进行SDS-PAGE，硝酸银染色，结果表明纯化得到了重组表达的目的蛋白。用大肠杆菌进行的初步实验表明，重组蛋白具有一定的生物学活性，能够提高大肠杆菌的抗冻能力。纯化的目的蛋白用超滤装置浓缩脱盐，用Bradford方法测定浓度。另外，野生型120个氨基酸的黄粉虫抗冻蛋白有22个半胱氨酸，他们形成11个二硫键，在稳定蛋白质的高级结构方面起着重要作用。本文用DTNB方法测定游离巯基，分析重组蛋白的折叠程度。结果表明重组蛋白不含游离巯基，结合活性测定结果，推测重组蛋白折叠完好。