抗冻蛋白是20世纪60年代首先从极地鱼血淋巴中分离的一种蛋白质，它可以抑制冰晶的生长并以非依数形式降低溶液的冰点，不影响熔点，因而导致溶液的冰点与熔点出现一差值。对抗冻蛋白的基础研究及其在生物技术应用领域的研究已经成为目前国际上一个比较热门的研究方向。人们试图通过转基因方法使抗冻蛋白在原核生物中(如大肠杆菌)表达，利用生物反应器来定向生产AFP。但是就目前的实验结果来看，抗冻蛋白在原核生物体内往往不能被正确的加工而形成有活性的AFP，且用大肠杆菌表达的蛋白以包涵体的形式存在，这样对后续的分析工作十分困难。故我们建立了以毕赤酵母为宿主菌的表达系统。本实验拟通过毕赤酵母表达系统，利用毕赤酵母质粒pPIC9K中含有的酿酒酵母基因组的α因子，有效地分泌表达出具有生物活性的抗冻蛋白TmAFP，为TmAFP的应用研究打下结实的基础，并在条件合适的情况下工业化。 本论文思路如下：采用PCR技术，以pMAL-p2X-afp84a和pMAL-p2X-afp72载体为模板扩增出afp84a，afp72基因，克隆到pUCm-T 载体中测序并保存。按分子克隆的方法，通过双酶切将afp84a，afp72基因定向重组到毕赤酵母表达载体pPIC9K中。然后用醋酸锂转化法将重组质粒转化入毕赤酵母宿主菌GS115，通过选择性培养基MM和MD筛选出重组毕赤酵母菌株。用0.5％甲醇诱导表达，在最适温度30℃的环境条件下，诱导表达出活性蛋白，用硫酸铵浓度梯度沉淀初步纯化酵母真核表达产物，通过细菌低温保护实验检测抗冻蛋白TmAFP低温保护功能，同时探讨抗冻蛋白TmAFP在酸碱环境和100℃时的稳定性。研究表明TmAFP真核表达产物在低温下能够提高细菌的存活率，能够耐受高温和一定程度的强酸强碱。