论文部分内容阅读
目的:通过不同浓度的蛋白LBP、sCD14、BPI及HDL、LDL、VLDL与LPS单独或共同作用于单核巨噬细胞,观察细胞活化分泌细胞因子情况,反映它们在LPS的体内结合、转运和活化过程中的单独及总体调节效应。
方法:
1.实验细胞制备:将传代后的THP-1细胞转化为巨噬细胞,洗涤,加入无血清RPMI1640继续培养12小时,做为实验细胞。
2.LBP对LPS的调节作用分为四组:LPS组；LBP组；预孵育组(LPS/LBP以一定浓度混合37℃预孵育15分钟)；不孵育组(两者以相应比例直接加入细胞)。分别培养4、12、24小时。
3.sCD14对LPS的调节作用
分为三组:sCD14组(终浓度为1、0.5、0.1、0.01μg/ml)；sCD14/LPS预孵育组(LPS终浓度为10、1ng/ml,sCD14终浓度为1、O.5、0.1、0.01μg/ml,两者混合后37℃孵育15分钟)；sCD14/LPS不孵育组(LPS终浓度为10、1ng/ml,sCD14终浓度为1、0.5、0.1、0.01μg/ml,两者直接加入细胞),培养4小时。
4.BPI对LPS和LBP的调节作用
分为三组:BPI组(终浓度为200、20、2ng/ml)；BPI/LPS组(LPS终浓度为1ng/ml,BPI终浓度为200、20、2ng/ml,两者直接加入)；BPI/LPS/LBP组(LPS终浓度为1ng/ml,BPI终浓度为200、20、2ng/ml,LBP终浓度为100、10、1、0.1ng/ml,三者直接加入细胞),培养4小时。
5.脂蛋白对LPS的调节作用
三种脂蛋白(HDL,LDL,VLDL)分别进行试剂对照和混合孵育实验。对照组中终浓度为0.1、0.075、0.05、0.025mg/ml脂蛋白与血清孵育六小时；实验组中终浓度为0.1、0.075、0.05、0.025mg/ml脂蛋白分别与终浓度为100、10、1ng/ml LPS混合并加入血清孵育六小时,加到细胞中,培养4小时。
6.多种调节蛋白的混合作用
选取LPS,LBP,sCD14,BPI,HDL五个因素两个水平进行正交设计,选定实验浓度,配制混合试剂,直接加到细胞中,培养4小时。
7.吸出培养上清液,化学发光法检测细胞因子。
8.对结果进行统计学分析。
结果:
1.THP-1细胞为悬浮生长,经PMA诱导转化后为巨噬细胞,改变生长特性为贴壁生长。
2.LPS单独刺激巨噬细胞分泌TNF-α,1ng/ml和其它组间有显著性差异(P＜0.05),10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml三组间无显著性差异(P＞0.05)。
3.LBP单独刺激巨噬细胞,浓度为1000ng/ml时,TNF-α和IL-β分泌最高。LBP/LPS两者混合,在比值为10或1,分泌TNF-α和IL-β量最高,增加或降低LBP浓度,分泌减少。孵育后,则曲线平缓,无明显高峰。经析因分析,LPS和LBP(F=3.425,P＜0.01),是否预孵育和培养时间(F=4.240,P=0.026),LBP浓度和是否预孵育(F=4.896,P＜0.01),均有交互作用。
4.sCD14单独对巨噬细胞无刺激作用。未经孵育,1μg/ml sCD14能明显增强LPS刺激细胞分泌FNF-α,孵育后,则增强作用减少甚至消失。是否孵育两组数据比较,结果有显著性差异(z=1.57,P=0.014)。
5.使用不同浓度BPI刺激巨噬细胞分泌TNF-α,结果间无显著性差异(F=0.590,P=0.584)。在LPS中是否加入BPI进行刺激,结果间有显著性差异(z=-2.501,P=0.012)。2ng/mlBPI和不同浓度LBP混合可以完全抑制1ng/mlLPS作用。
6.脂蛋白单独对THP-1细胞无刺激作用。HDL、LDL和VLDL对100ng/mlLPS刺激分泌TNF-α的抑制率最低(分别为20％、7.8％、4.3％),对10ng/ml LPS抑制效果明显(抑制率分别为69％、42.9％、42.7％)。HDL抑制效果强于LDL和VLDL。
7.混合实验中,巨噬细胞分泌TNF-α量与sCD14、BPI的单独效应有关(P＜0.05),并与LBP和sCD14、LBP和HDL、LPS和LBP的交互作用有关(P0＜.05)。
结论:
1.LPS是活化单核巨噬细胞的重要物质。在无血清基质中低浓度LPS可以单独引起巨噬细胞释放炎性因子,当LPS达到一定浓度,LPS刺激可出现饱和现象。
2.高浓度LBP能活化巨噬细胞。低浓度LBP能增加LPS对巨噬细胞活化,并随LBP浓度增加而增加；高浓度LBP对LPS活化有负性调节作用。
3.sCD14能增强LPS的作用,增强作用在LPS高浓度时明显,未见双向调节性。
4.BPI能抑制LPS作用,在LBP存在情况下作用更明显,与BPI浓度无明显关系。
5.脂蛋白能抑制LPS对巨噬细胞的作用,对低浓度LPS抑制明显,对高浓度LPS不明显。
6.混合体系中,巨噬细胞的活化与sCD14、BPI的单独效应有关,并与LBP和sCD14、LBP和HDL、LPS和LBP间的交互作用有关。
7.体外单核细胞经PMA诱导分化成巨噬细胞,再用LPS刺激,IL-10无明显分泌,引起炎性和负炎性因子的失衡。