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研究背景:目前,在所有恶性肿瘤中,肾癌（renal cell carcinoma,RCC）约占其中的2～3%,是最常见的成人恶性肿瘤之一,其中肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma,ccRCC）是发病率和致死率最高的亚型,约占肾癌的75%。目前对于局灶性或寡转移性肾癌患者,外科手术治疗仍是首选,但约1/3的患者术后会复发或者出现新的转移灶。放射治疗作为一种常见的辅助治疗方法,在很多肿瘤治疗中能有效控制病灶发展,改善预后。遗憾的是,肾癌对放疗不敏感,临床上也不是肾癌患者术后的常规辅助治疗手段之一。近年来,随着放疗技术的进步及新研发的放疗增敏剂的辅助,放疗的适用性及疗效有了很大的突破,很多肿瘤的放疗抵抗有所缓解。就肾癌而言,目前迫切需要探索其放疗抵抗的机制,为临床制定个性化的放疗方案提供理论依据,从而改善肾癌患者的预后及生存质量。DIRAS2是Ras家族中独特亚群的一员。尽管序列相似,但DIRAS2在生化和功能特性上与其他已知的Ras家族成员不同。DIRAS2通常主要在人的大脑中表达,最初也是在注意力缺陷/多动性障碍（Attention Deficit/Hyperactivity Disorders,ADHD）患者的研究中被发现的。近年来,有越来越多的报道称DIRAS2可能参与了肿瘤的发生和发展。在缺失Von Hippel-Lindau蛋白（pVHL）的情况下,DIRAS2作为丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的激活因子被证明在肾透明细胞癌中具有潜在的致癌作用。在卵巢癌中,DIRAS2被发现表达下调,并与总体生存期和无进展生存期降低相关。另外在小鼠卵巢癌细胞中发现,DIRAS2通过增强自噬水平诱导细胞死亡。总体看来,DIRAS2相关的生物学功能及在肿瘤进程中扮演的角色,在广度和深度上都有较大的研究空间。到目前为止,也还没有DIRAS2与肿瘤放疗抵抗相关的报道。大自噬（macroautophagy,以下简称自噬）是一种负责清除细胞内受损细胞器、长寿蛋白和错误折叠蛋白的分解代谢过程,对维持细胞内稳态及适应细胞微环境变化具有至关重要的作用。传统观点认为,自噬对细胞受到的各种形式的应激原刺激起保护作用,如明显的环境变化或遭遇电离辐射（ionizing radiation,IR）、活性氧等导致的大分子损伤,但也有报道称自噬以细胞毒性的方式对电离辐射做出反应。自噬与辐射抗性的关系已被广泛研究,但仍需要深入探索内在的机制来解释自噬在电离辐射应激中的矛盾作用。在本研究中,我们旨在探究DIRAS2在肾透明细胞癌放疗抵抗调控中的确切作用,及潜在机制和相关的信号通路。研究目的:1.验证DIRAS2在人ccRCC中高表达。2.探究过表达DIRAS2对ccRCC放射抵抗的影响。3.探究过表达DIRAS2对ccRCC自噬水平的影响及自噬在放射抵抗中的作用。4.探究DIRAS2对ccRCC自噬相关信号通路的影响。研究方法:1.借助Oncomine和TCGA数据库,对DIRAS2在人ccRCC和正常肾小管上皮组织中的表达情况进行数据挖掘,用SPSS或Prism软件对挖掘出的各组数据进行t检验,分析DIRAS2在ccRCC组织与正常肾小管上皮组织中mRNA水平的差异。2.分别采用qPCR和WB技术,验证DIRAS2在ccRCC细胞系（786-O、A498、Caki-1、ACHN）与正常人肾小管上皮细胞（HK-2）中mRNA和蛋白水平的差异。3.对收集的ccRCC患者手术标本的石蜡切片进行免疫组化检测,比较DIRAS2在ccRCC组织与相应癌旁组织间的表达差异。4.利用慢病毒载体构建ccRCC（A498和786-O）的过表达细胞系（DIRAS2-OV）和阴性对照细胞系（Lv-NC）,用嘌呤霉素筛选出稳转细胞株,并利用qPCR和WB技术对细胞的过表达情况进行检验。5.不同处理组的细胞接受0、2、4、6Gy的电离辐射（IR）,根据克隆形成实验的结果,计算不同IR剂量下各组细胞的存活分数,用单击多靶模型公式拟合并绘制不同组的剂量-存活分数曲线,从而推导出平均致死剂量（D0）、准阈值剂量（Dq）和2Gy的细胞存活率（SF2）,以此来分析各组细胞的放疗抵抗能力差异。6.通过免疫荧光及WB实验,对IR处理后的细胞的自噬标志蛋白LC3进行半定量分析,以此来评估IR处理前后,过表达组（DIRAS2-OV）和对照组（Lv-NC）细胞的自噬水平的差异。7.通过自噬抑制剂-氯喹（CQ）处理细胞,拟阻断细胞的自噬进程,再通过WB实验检测处理组和未处理组细胞自噬标志蛋白LC3及P62来评估CQ阻断自噬的效果,通过不同剂量IR处理后细胞的克隆形成实验,来探究自噬水平对细胞放射抵抗的影响。8.运用WB实验,对自噬相关的MKK4-JNK1-Bcl-2信号通路的蛋白分子表达水平进行检测。研究结果:1.DIRAS2在ccRCC中高表达:对TCGA和Oncomine数据库中获取的数据分析得DIRAS2在肾透明细胞癌中的表达显著高于正常肾小管上皮组织（P＜0.05）。临床石蜡标本的免疫组化的结果证实,DIRAS2在肾透明细胞癌组织中的表达高于癌旁组织。qPCR和WB结果证实,DIRAS2在ccRCC细胞系中的表达显著高于正常肾小管上皮细胞。2.过表达DIRAS2增强了 ccRCC细胞的辐射抗性:根据克隆形成实验结果及单击多靶模型公式拟合绘制的剂量-生存分数曲线可看出,DIRAS2-OV组的ccRCC细胞在不同电离辐射（IR）剂量下均具有更高的克隆存活率。经过公式推导出,DIRAS2-OV组具有更高的D0、Dq及SF2值,且具有统计学差异（P＜0.05）,即DIRAS2-OV组具有更高的辐射抗性。3.过表达DIRAS2能提高ccRCC细胞在IR刺激下的自噬水平:WB实验结果表明,DIRAS2-OV组和Lv-NC组在同剂量IR（6Gy）刺激后的24小时内,自噬标志蛋白LC3都呈现先递增再递减的趋势,但DIRAS2-OV组LC3/GAPDH的比值明显高于Lv-NC组。细胞免疫荧光的结果表明DIRAS2-OV组,不管是否接受IR刺激,都具有更强的LC3荧光信号,且IR刺激后更明显。4.自噬抑制剂氯喹（CQ）能削弱过表达DIRAS2对ccRCC辐射抗性的增强效果:WB实验结果显示,CQ处理后,自噬标志蛋白LC3和P62的消耗均减少,积累量增加,即CQ抑制了自噬的进程;克隆形成实验显示,加CQ的两组细胞的辐射抗性无明显差异,而未加CQ的两组与结果2相似。5.WB结果表明,DIRAS2能激活MKK4-JNK1-Bcl-2通路。研究结论:1.DIRAS2在人ccRCC中高表达。2.过表达DIRAS2能显著增强ccRCC细胞的辐射抗性。3.电离辐射刺激下,ccRCC细胞的自噬水平显著提高,且过表达DIRAS2能进一步促进自噬。4.过表达DIRAS2引起的ccRCC细胞辐射抗性增加与自噬水平升高相关。5.DIRAS2通过激活MKK4-JNK1-Bcl-2信号通路诱导自噬,从而增强了 ccRCC细胞的辐射抗性。